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柳欣欣，赵艳，陈平，陈昕 扬州大学临床医学院 江苏省苏北人民医院 美国加利福尼亚大学 目的：探讨ω-3脂肪酸脱氢酶Fat-1基因对细胞脂肪酸谱的影响，并对AKT/Ras癌基因激活小鼠肝癌细胞的抑制作用。 方法：通过构建pLenti-CMV-Fat-1过表达慢病毒载体，使小鼠AKT/Ras肝癌细胞转染Fat-1基因，以pLenti-CMV-GTP空载体病毒作为对照，观察Fat-1基因对小鼠AKT/Ras肝癌细胞增殖及克隆形成率的影响。蛋白质印迹法检测癌基因信号通路p-AKT和p-Erk的表达情况，并检测两组细胞脂肪酸谱的改变情况。 结果：Fat-1基因可明显增加细胞ω-3/ω-6脂肪酸的比率，并抑制AKT/Ras癌基因信号通路，抑制肝癌细胞的增殖和克隆形成。 结论：Fat-1基因通过增加内源性ω-3多不饱和脂肪酸来抑制AKT/Ras肝癌细胞的增殖。 原发性肝癌是全球癌症导致死亡的首要原因之一【1-2】。最近，通过大通量基因组筛查方法确定了一系列与肝细胞癌和肝内胆管癌发生、发展有关的突变基因和相关信号通路【3】。其中AKT和Ras癌基因是致人类肝癌发生的重要信号通路。前期我们成功建立了小鼠肝癌发生模型，并分离培养获得了AKT/Ras小鼠肝癌细胞系【4-5】。 ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3PUFA）是一种特殊的脂肪酸，具有抑制肿瘤等有益作用【6-7】。而ω-6PUFA则具有相反的不利影响，如有促炎【8】、促肿瘤增殖【9-10】、侵犯转移【11】和促进肿瘤血管生成等【12-13】。Fat-1基因是来源于线虫的脂肪酸脱氢酶，可将ω-6PUFA转化为有益抗肿瘤的ω-3PUFA。我们通过将Fat-1基因导入AKT/Ras癌基因激活的小鼠肝癌细胞系，来研究Fat-1基因对AKT/Ras癌基因激活小鼠肝癌细胞的抑制作用。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 293T细胞、大肠杆菌DH5a由本实验室保存；AKT/Ras癌基因激活的小鼠肝癌细胞株为UCSF陈昕教授惠赠【4-5】；pMD-19T-Fat-1基因质粒由上海交通大学吴际教授惠赠；慢病毒包装系统pRSV-Rev、pMDL、pRRE和plenti-CMV-GFP-puro，pENTR 1A Dual Selection Vector，LR Clonase II Enzyme Mix，OneShot ccdB Survival 2T1R感受态，Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；限制性内切酶SmaI和RcorI购自Fermentas公司；T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司、DNA高保真聚合酶购自诺唯赞生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒和PCR纯化试剂盒购自Axygen公司；DMEM高糖培养液、PBS、胎牛血清以及胰酶购自HyClone公司；酵母膏和胰化蛋白胨购自英国Oxoid公司；DB23气相色谱柱购自美国Agilent公司；BF3/甲醇试剂（14%三氟化硼）、正己烷购自德国CNW公司；37种脂肪酸混合标准品购自Nu-chek-Prep公司；PCR引物合成及测序由华大基因公司完成。兔源抗p-Akt、Akt、p-Erk、Erk单克隆抗体，山羊抗小鼠IgG作二抗购自cellsignal公司。 1.2 重组慢病毒质粒plenti-CMV-Fat-1的构建 以测序正确的pMD-19T-Fat-1质粒为模板，根据已测得的全长序列设计引物，进行PCR扩增。上游引物为：5'-ATGGTCGCTCATTCCAGCGAA-3'，其中导入NotI酶切位点；下游引物序列为：5'-TCACTTGGCCTTTGCCTTCTC-3'，其中导入EcoRV酶切位点。PCR产物经NotI和EcoRV酶切后连接于pENTR1A载体，转化ccdB Survival感受态细胞。挑取单个阳性克隆（Kan+）培养扩增，提取重组质粒pENTR1AFat-1，提交华大基因公司进行测序分析。将测序正确的质粒pENTR1A-Fat-1与plenti-CMV-DEST-puro混合。在重组酶的催化下，室温孵育1h发生重组反应（LR）。转化反应产物到大肠杆菌DH5a感受态，在氨苄抗性的培养基平板上筛选阳性克隆plenti-CMV-Fat-1，再次测序正确。 1.3 重组慢病毒包装 转染前24h，取对数生长期的293T细胞按1.5×10+5cell/ml接种于六孔板，待细胞密度达70%时，取混合好的pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、VSV-G共1.8μg和载体plenti-CMV-Fat-1，plenti-CMV-GFP2μg，与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，共转染293T包装细胞。使用DMEM＋30%FBS的细胞培养液后，继续培养24、36和48h分别收集细胞上清液，经过离心和过滤收集病毒浓缩液。 1.4 转染 Fat-1基因的AKT/Ras癌基因激活的小鼠肝癌细胞株将AKT/Ras小鼠肝癌细胞系铺入6孔板内，孵育过夜；将细胞分为阴性对照组（转染GFP慢病毒）和实验组（转染Fat-1慢病毒）。病毒转导48h后，使用1mg/ml嘌呤霉素筛选，培养2周左右，获得稳定转染细胞株（AKT/Ras-GFP和AKT/Ras-Fat-1），用于细胞增殖、克隆形成及提取蛋白等检测。 1.5 检测细胞增殖及克隆形成 1.5.1 检测细胞增殖情况 将细胞铺于24孔板，加入AKT/Ras-GFP和AKT/Ras-Fat-1两组细胞，重复3孔实验，每孔初始细胞数为3000个。分别在培养后第1、3、5和7天进行戊二醛固定，并用结晶紫染色细胞，PBS洗脱未染色的结晶紫。加入10%的乙酸对细胞吸收的结晶紫进行提取，1h后在酶标仪上使用波长595nm测定光吸收度。 1.5.2 克隆形成实验 将细胞铺于6孔板，重复3孔实验，使每孔的细胞数为1000个，放置培养2周后固定，进行细胞结晶紫染色，计数每孔克隆数。 1.6 检测AKT、Erk蛋白表达 收集两组细胞后，冰上裂解30min，提取细胞总蛋白，蛋白质印迹法分析。加入兔源抗p-Akt、Akt、p-Erk、Erk单克隆抗体（1∶1000）孵育过夜，TBS-T充分洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作二抗（1∶1000），孵育1h，TBS-T充分洗涤，ECL显影。GAPDH为内参基因，每实验组设3个复孔，实验重复3次。 1.7 乳酸菌脂肪酸的甲酯化 按照Kang等【14】的方法将脂质提取及甲酯化合为一步。在16ml特氟龙内衬瓶盖的玻璃试管中将1ml正己烷和50μl细胞沉淀物混匀，加入1mlBF3/MeOH（14%三氟化硼）试剂。并将该混合物在金属砧板95℃加热1h，冷却至室温，加入1ml双蒸水，样品静置20～30min，取上清，脂肪酸甲酯化萃取在己烷相。 1.8 分析脂肪酸 采用美国Agilent7890A气相色谱仪，色谱柱DB-23，0.25mm×60m×0.25μm，进样口温度为250℃；进样量为1μl；分流比为1∶50；载气为氢气，柱前压53kPa恒压（36cm/s，50℃）；氢离子火焰检测器（FID）：温度280℃；柱温：50℃，1min，以25℃/min升温至200℃，以3℃/min升温至230℃，18min；气体流量：检测器气体氢气30ml/min，空气300ml/min，氮气25ml/min。以37种脂肪酸甲酯混标做对照，检测样本中各种脂肪酸的相对含量。 1.9 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，t检验进行组间比较。P≤0.05为差异有显著性统计学意义。 2 结果 2.1 Fat-1基因显著抑制小鼠肝癌细胞克隆形成及增殖能力 慢病毒转染Fat-1基因，相对于转染GFP对照的稳转细胞系，AKT/Ras细胞克隆形成能力显著降低，见图1A。导入Fat-1基因也使AKT/Ras细胞生长速度显著减慢，见图1B。在实验开始至细胞生长第7天，细胞固定结晶紫染色后，提取溶解测得的A值590nm存在显著差异（0.895±0.134，0.621±0.110，P＜0.05）。 2.2 Fat-1基因抑制AKT/Ras信号通路蛋白活化 慢病毒转染Fat-1和GFP对照的稳转细胞系提取蛋白，行AKT和Erk等蛋白印迹检测。各种蛋白印迹相对于内参GAPDH的印迹灰度比值进行比较。结果显示，p-AKT表达Fat-1转染细胞较GFP转染细胞蛋白印迹灰度比值降低，p-Erk的表达在Fat-1转染细胞亦明显降低。稳转Fat-1基因的AKT/Ras细胞系，磷酸化的p-AKT和p-Erk表达明显被抑制，见图2。Fat-1基因抑制了AKT、Ras信号通路的激活。 2.3 Fat-1基因显著改变AKT/Ras细胞脂肪酸谱 慢病毒转染Fat-1稳转AKT/Ras细胞系后，脂肪酸谱检测发现，Fat-1基因明显改变了细胞的脂肪酸谱构成，见图3和表1。Fat-1基因减少了ω-6PUFA，相应的增加了ω-3PUFA。ω-6/ω-3比值由原来的12.2改变为0.6，差异有显著性统计学意义（P=0.0002）。 3 讨论 3.1 ω-3PUFA可抑制肿瘤发生发展，ω-6PUFA则具有相反的不利影响 脂肪酸在各个方面促进肿瘤发生发展，脂肪酸为肿瘤细胞增殖提供构建细胞膜的脂质材料【15】和细胞信号通路的脂质分子【16-18】，并为肿瘤细胞提供能量来源【19-20】。因为机体缺乏脂肪酸Δ12、Δ6、Δ3等去饱和酶，哺乳动物细胞合成PUFA的能力有限，脂质合成作用只可使肿瘤细胞膜产生饱和脂肪酸和（或）单不饱和脂肪酸【21】。流行病学研究提示，ω-3PUFA有着预防肿瘤发生的有益作用。Kimura等【22】研究发现，结直肠癌的发生率与ω-3PUFA的人群摄取率呈负相关。Theodoratou等【23】研究也发现，ω-3PUFA摄取量增高可降低结肠癌的患病率，且不管是EPA还是DHA都呈剂量依耐性。Chavarro等【24】前瞻性的研究也提示，血液中ω-3PUFA水平与前列腺癌患病率呈负相关。而ω-6PUFA在很多方面则具有相反的不利影响，如有促炎【8】、促肿瘤增殖【9-10】、侵犯转移【11】和促进肿瘤血管生成【12-13】等有害作用。 3.2 Fat-1基因可将ω-6PUFA转变为ω-3PUFA，从而抑制肿瘤发生发展 在线虫中发现的Fat-1基因，可在不饱和脂肪酸的烃链中添加一个双键，将ω-6PUFA转变为ω-3PUFA【6，25-26】。本研究检测证实，慢病毒转染Fat-1稳转AKT/Ras细胞系后，Fat-1基因显著减少ω-6PUFA，并相应的增加了ω-3PUFA，从而ω-6/ω-3比率显著降低。人体缺乏像线虫一样功能的ω-3脂肪酸脱氢酶。利用Fat-1转基因小鼠的动物实验证实，ω-3PUFA可抑制黑色素瘤的生长【25】，抑制结肠癌的发生【26】，降低前列腺癌的基因风险【27】，促进乳腺细胞的分化，从而降低乳腺癌的发生风险【6-7】。 3.3 Fat-1基因或ω-3PUFA可抑制多种肿瘤的AKT和Ras癌基因信号通路 不受控制的Ras/MAPK和AKT/mTOR【28-31】癌基因通路激活在肝癌恶性转化和进展过程中起着重要作用。AKT/mTOR信号通路对包括肝癌细胞在内的多种细胞，有多方面的作用，影响细胞生长、存活和转移等【32-33】。同样，Ras蛋白作为GTP家族调节分子家族成员之一，对细胞增殖、存活和转移等信号通路起调节开关的作用【34】。Ras蛋白一旦激活后，就能诱导RAF蛋白激酶，磷酸化激活MAPK激酶，接着激活细胞外信号调节激酶ERK，最终上调下游的靶基因【34】。有研究证实，N-Ras和AKT癌基因有相互协同作用，共同作用促进肝癌发生和发展【4-5】。 Hu等【35】的研究证实，DHA可抑制前列腺癌的PDK1/Akt的信号通路。Collett等【36】的研究证实，ω-3PUFA可抑制结肠癌细胞Ras信号通路，而ω-6PUFA对Ras信号通路有相反的作用。本研究结果得出类似结论。脂肪酸脱氢酶Fat-1基因，可使细胞内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，内源性ω-3PUFA可抑制AKT和Ras癌基因信号通路，并可进一步抑制肝癌细胞增殖和克隆形成能力。目前的研究表明，Fat-1基因抑制AKT/Ras癌基因信号通路，是通过改变ω-3/ω-6PUFA的比率，使内源性的ω-3PUFA增多而起作用的。本课题的体外细胞实验，为进一步小鼠体内实验和临床研究奠定基础。 原文参见：肠外与肠内营养. 2016;23(4):237-241. |
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