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1 实验材料准备 以洋葱内表皮为材料，用刀片切取洋葱表皮并用镊子小心剥取内表皮(大小约为2×2cm)，刀片和镊子均经过70%乙醇消毒，以防止污染。剥取洋葱表皮于高渗培养液(MS无机盐、40g/L 甘露醇)中，室温100rpm处理4h;然后转入高渗固体培养基(MS无机盐、40g/L甘露醇、0.7 %agar)备用。 2 钨粉准备 1)称取60mg钨粉放入1.5 mL离心管。 2)加入1mL的无水乙醇，涡旋振荡1 ~2min。 3)冰上静置5min后，10000rpm离心1 min,去上清。 4)重复1, 2步骤重新清洗钨粉二次。 5)室温，10000rpm，离心1 min,去上清。 6)加入1mL无菌去离子水，涡旋振荡1~2min，冰上静置5min。 7)室温，10000rpm，离心1 min,去上清。 8)重复7步骤两次。 9)加入1mL无菌去离子水，按50μL每份分装到已火菌的1.5 mL离心管中备用(分装时应在无菌条件下边涡旋振荡，以保证分装均匀)。 3 DNA包裹钨粉微粒(具体实验可按比例进行以下操作) 1)取50μL钨粉悬浮液(已分装好)，在连续涡旋振荡下按顺序加入5μL质粒DNA (1 μg/μL) 50μL，2. 5 M CaC12，20μL 0.1 M亚精胺。 2)涡旋振荡3 min。 3)室温下离心10000rpm 10sec，尽可能去净上清。 4)加入250无水乙醇，涡旋振荡1~2 min。 5)室温下离心10000 rpm l0sec，尽可能去净上清。 6)加入60μL无水乙醇(可进行4~8次轰击)。 4 基因枪轰击操作 无菌条件下操作 (1)超净台紫外灯灭菌20 min; (2)载物膜，可裂膜，阻拦网、holder等事先置于70%乙醇中浸泡，灭菌滤纸上自然风干;将气瓶调节压力到1300 psi; (3)取8~9μL已用DNA包裹好的微粒悬浮液加到微粒载体膜中央，稍微晾干后马上进行轰 击。 (4)将可裂膜，阻拦网，涂有微粒的载体膜安装进固体装置中，射击参数为:轰击微粒运行距离为9/12cm各一次，压力1350 psi，真空度20 mmHg。 (5)将轰击结束后的材料，置于等渗培养基MS上暗培养约24h。 (6)使用激光扫描共聚焦显微镜或荧光显微镜在488 nm波长激发下观察GFP的表达。 |
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