 一、背景介绍食管癌（EC）是主要的恶性肿瘤之一，东亚地区90%食管癌为食管鳞癌（ESCC)。由于进展快且对化疗不敏感，病人预后较差。越来越多证据表明lncRNA可能是ESCC的一种生物标志物，部分lncRNA在ESCC中发挥原癌基因作用。 二、流程图三、结果分析1.使用“edgeR”与“DEseq”R包进行差异表达的lincRNAs(DELs)鉴定作者使用R包“edgeR”与“DEseq”对肿瘤组织与周边正常组织lincRNAs表达进行对比，共鉴定了502个 表达差异的lincRNAs ，223个高表达， 279个低表达。 2.8个lincRNA标志物的确立与验证对DELs进行单因素归分析，使用LASSO分析找到了33个可用于OS预测的lncRNA。最终确定了8个lincRNA用于ESCC风险预测。 使用R包 “glment”, “survminer” and “survival”进行多元cox回归分析，确定8个lincRNA的相关系数，其中LINC01711对评分贡献最大，LINC01592贡献最小。依据 8个标志物的表达水平对病人进行风险评分，将病人化分为高低风险两组，对比两组生存时间与标志物表达。 风险评分 = 18.977 × (expression level of AP000487) + 11.606 × (expression level of AC011997) + 0.023 × (expression level of LINC01592) + 3.658 × (expression level of LINC01497) 24.196 × (expression level of LINC01711) + 3.164 × (expression level of FENDRR) + 0.228 × (expression level of AC087045) + 10.548 × (expression level of AC137770) 2A: 8个标志物的确立过程。 2B/C:GEO和 TCGA数据集中， 预后标志物与OS间关系。由上至下依次为病人的风险评分，生存时间，8个lincRNA 表达。低风险组病人生存时间较长。 对高低风险组进行生存，判断使用8个lincRNA标志物进行风险评分的OS预测效果，低风险组病人OS显著优于高风险组（3A/B）。为验证8个标志物的OS预测真实性，作者使用 R 包 “survivalROC“做OS预测的ROC曲线，0.5-, 1-, 3-, 5-year AUC在GEO和 TCGA数据集中分别为0.673, 0.734, 0.798, 0.816, 0.795 和 0.777, 0.644, 0.642, 0.649, 0.765 ，表明8个标志物的OS预测效果较好，准确度高（3C/D）。 3.不同亚组下标志物作用验证依据标志物表达进行的风险评分在不同年龄，分期，分级的病人中，均可作为预测OS的生物标志物，高低风险组病人生存时间有显著差异。 4.OS相关临床指标单因素与多元cox回归分析对OS相关临床指标进行单因素cox回归分析，TCGA数据集中的grade, stage, N stage和risk score , GEO数据集中的 stage, risk score可作为OS的预测指标（5A,5C）。为验证各个因素的独立性，进一步对相关指标进行多元cox回归分析，结果表明TCGA数据集age,risk score, GEO数据集中的stage,risk score可以作为独立的风险因素（5B,5D），综合证明标志物可作为ESCC独立的预后风险因素。 5.建立列线图结合病人年龄，肿瘤分级，分期以及8个标志物的表达，建立列线图（6A），做出校准曲线及KM生存曲线，观察列线图的预测效果。校准曲线与表示实际生存概率的45º斜线偏差较小（6B），表明列线图的预测准确度较高。且KM生存曲线中，综合所有临床指标进行预测的曲线AUC高于单一使用肿瘤分级，分期与病人年龄进行预测的曲线AUC,表明与单一因素相比，各临床指标与标志物表达相结合的列线图有更高的预测准确度（6C）。 6.WGCNA分析作者使用R 包“WGCNA”进行WGCNA分析，以相关系数>0.6,P<0.001为标准，筛选标志物lincRNA共表达基因,然后筛选出其中的差异表达基因(7A)。设置β = 5，使用平均连接聚类法，相似基因被分在不同模块（7C）。作者计算出各模块基因总表达水平，并按照模块因间的关联将其再分为8个模块（7D），进一步分析基因与临床因素间的关系。 作者对各模块基因与生存时间之间的关联进行分析。计算各个模块生存时间相关基因的显著性与标准差，以此估算生存时间与基因表达间的关系（8A），做出模块主成分散点图，绿色模块与生存时间关联最强，棕色模块与生存时间负相关，蓝色和红色模块与生存时间正相关（8B）。然后对8个模块进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。GO功能富集分析包括生物过程，细胞组成与分子功能三部分。主要影响的生物过程为角质形成细胞分化，肽链交联，表皮细胞分化；主要影响的生物功能为多肽酶活性，L-氨基酸多肽链活动，肽链内切酶抑制剂活性；主要影响的细胞成分为中间丝细胞骨架，角蛋白丝。KEGG通路富集分析显示8个模块的基因与甲型流感，化学致癌和药物代谢有关（8C）。 同样，作者对各个模块基因与T分期间关系进行分析。计算各个模块T分期相关基因的显著性与标准差，以此估算生存时间与基因表达间的关系（9A），做出模块主成分散点图，黑色模块与T分期关联最强，蓝色模块与T分期负相关，绿色模块与T分期正相关（9B）。然后对8个模块进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。主要影响的生物过程为细胞外基质组成；主要影响的生物功能为金属肽酶活性， 金属内肽酶活性，胶原结合；主要影响的细胞成分为内质网。KEGG通路富集分析显示8个模块的基因与蛋白质的降解利用有关（9C）。 7B:软阈值选择。β = 5为最佳软阈值，基因分布符合无尺度网络。 7F:分级聚类与关键基因网络热图。8个模块被归为两类，热图展示了模块间的相关性。
小结 作者通过对GEO,TCGA数据集的分析，确立了8个可作为ESCC预后标志物的lincRNA，结合其他预后相关临床指标建立列线图，用于ESCC病人预后预测，生存预测效果优于传统分级系统。同时为研究相关分子机制，作者通过WGCNA分析，将8个lincRNAs标志物相关基因分为不同模块，并对模块相关功能进行分析。 |
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