【综述】| CDK4/6抑制剂治疗三阴性乳腺癌的研究进展

引用本文

朱秀之，陈　力，纪　磊，等. 微囊型脑膜瘤2例临床病理学特征分析并文献复习［J］. 中国癌症杂志, 2019, 29 (11): 899-905.

基金项目：北京乳腺病防治学会乳腺癌预防与诊治科研基金（2016）；上海市抗癌协会青年医生“雏鹰”项目（2018）（SACA-CY1B02）。

通信作者：王中华 E-mail: [e-mail]

CDK4/6抑制剂治疗三阴性乳腺癌的研究进展

朱秀之，陈　力，纪　磊，高　雨，王中华

复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科，上海市乳腺肿瘤重点实验室，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

［摘要］ 细胞周期的调控机制在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。多项研究表明，在雌激素受体阳性、人类表皮生长因子受体阴性的乳腺癌患者中，细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin-dependent kinase 4/6，CDK4/6）抑制剂具有较好的疗效，然而其在三阴性乳腺癌患者中的疗效仍需进一步探讨。Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信号通路因具有调控细胞周期检查点的作用，被认为是乳腺癌潜在的治疗靶点。寻找三阴性乳腺癌与CDK4/6抑制剂关联的生物标志物，探究合理的药物配伍，筛选能从中获益的靶向人群，对临床工作具有重要意义。对CDK4/6抑制剂在三阴性乳腺癌的研究进展进行综述，探讨其应用前景及优化手段。

［关键词］ 细胞周期蛋白依赖激酶4/6；细胞周期蛋白D和E；三阴性乳腺癌；视网膜母细胞瘤蛋白质；雄激素受体

［Abstract］ The regulatory mechanism of cell cycle plays an important role in the occurrence and development of tumors. In recent years, a number of studies have shown that cyclin-dependent kinase 4/6 (CDK4/6) inhibitors have good efficacy in patients with estrogen receptor-positive, human epidermal growth factor receptor-negative breast cancer, but their efficacy in patients with triple-negative breast cancer is still controversial. Cyclin D-CDK4/6 -INK4-Rb-E2F signaling pathway is considered as a potential therapeutic target for breast cancer due to its role in regulating cell cycle check points. It is of great significance to explore the molecular markers related to CDK4/6 inhibitors for triple-negative breast cancer, guide rational drug combination, and screen the population of triple-negative breast cancer patient who can benefit from this drug. In this article, we reviewed the research progress of CDK4/6 inhibitors in triple-negative breast cancer, and discussed their application prospects and optimization methods.

［Key words］ Cyclin-dependent kinase 4/6; Cyclin D/E; Triple-negative breast cancer; Retinoblastoma protein; Androgen receptor

　　三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是一类雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）均阴性的乳腺癌亚型。目前TNBC缺乏特异性的治疗靶点，相较于其他亚型，其远处复发风险较高，预后较差^［1-2］。国内外针对TNBC基因表达谱差异已鉴定出不同的亚群^［3-4］。在中国，Liu等^［5］采用人转录组芯片技术，将TNBC分为免疫调节亚型（immunomodulatory subtype，IM）、腔内雄激素受体亚型（luminal androgen receptor subtype，LAR）、间充质样亚型（mesenchymal-like subtype，MES）和基底样及免疫抑制亚型（basal-like and immune suppressed subtype，BLIS）4个分型。分子谱研究揭示了TNBC的分子异质性，强调寻找靶向治疗生物标志物的重要性。

　　哺乳动物中细胞周期分G₁、S、G₂、M期共4期。细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）在细胞周期进程中发挥重要作用。其中，CDK4/6活化调控G₁期到S期的转变^［6］。CDK作为细胞周期调控机制的核心部分，是各种恶性肿瘤在发生、发展过程中所必需的，以其为作用靶点的CDK抑制剂是近年来研究抗肿瘤药物的热点。

　　靶向细胞周期治疗的CDK4/6抑制剂对ER阳性的晚期乳腺癌患者疗效显著^［7］，有望为TNBC患者提供新的治疗方向。但是由于缺乏统一的靶向患者筛选标准和疗效评价因子，迄今为止，CDK4/6抑制剂在TNBC患者中的疗效并不确切。本文总结TNBC中CDK4/6抑制剂的作用机制及可能相关的联系通路，在基础实验水平和临床试验水平，对药物联合治疗及疗效评价分子进行综述，旨在探讨CDK4/6抑制剂在TNBC治疗中的应用前景及优化手段。

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CDK4/6抑制剂

1.1　CDK4/6在细胞周期调节中的信号通路

　　细胞有丝分裂周期是一个高度协调的过程，关键取决于细胞周期检查点控制^［8］。CDK4/6是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控着G₁期关键检查点，在乳腺癌细胞中磷酸化结合相应的细胞周期蛋白，形成的cyclin D-CDK4/6复合体介导视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化，引发Rb蛋白结构改变，继而释放转录因子E2F。E2F结合于DNA并促进G₁期到S期进程的关键基因的转录和增殖蛋白的合成释放，启动DNA复制^［9］。

　　Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信号通路受多方面联合调控。根据细胞类型的不同，cyclin D可以是cyclin D1、D2或D3。Cyclin D的正确合成和定位影响CDK4/6的活性^［10］。此外，CDK抑制因子2（CDK inhibitor 2，CDKN2）基因家族（如CDKN2A、CDKN2B）编码产生CDK4/6抑制因子INK4家族（如p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p19INK4d），竞争性结合CDK并抑制cyclin D-CDK4/6复合物的形成^［11］。Rb蛋白被CDK4/6在多个位点磷酸化，可联合其他Rb家族成员p107和p130共同抑制细胞在G₁早期的扩增。该通路持续激活的原因主要包括CDK4/6的富集、cyclin D1编码基因CCND1的扩增及p16INK4A基因的缺失等。

1.2　CDK4/6抑制剂在乳腺癌中的应用

　　目前数据显示，乳腺癌中cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F轴异常调节广泛存在，并且可能是乳腺癌发生的早期步骤^［12］，包括cyclin D1的富集、抑制剂p16的缺失、Rb蛋白磷酸化水平的提高等。有研究显示，在激素受体（hormone receptor，HR）阳性的乳腺癌中，29%~58%存在cyclin D1过表达或扩增，14%~25%存在CDK4过表达；在BLIS中发现CDKN2A的高表达和细胞周期蛋白E1的富集。另外，Rb的低表达、丢失和突变也更常见于BLIS^［13］。在乳腺癌、非小细胞肺癌等^［14］多种恶性肿瘤中均观察到了p16INK4A基因的缺失以及CCND1、CDK4、CDK6基因的扩增。此外，CDK4/6抑制剂还可能会激发免疫及阻断TNBC细胞的远处转移（肝、肺）^［15］。

　　第一代CDK抑制剂flavopiridol（alvociclib）由于缺乏特异性，呈现出大剂量限制性毒性。对于进展性TNBC患者的UCN-01Ⅱ期临床试验，疗效依旧令人失望而未能成功应用于临床^［16］。新一代的CDK4/6抑制剂经过改造以后，具有一定的特异性和可以耐受的不良反应，典型代表有palbociclib、ribociclib、abemaciclib等，目前多种CDK4/6抑制剂临床试验正在进行。2015年2月美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）根据PALOMA1^［17］Ⅱ期研究批准palbociclib联合来曲唑一线治疗绝经后HR /HER2^-的晚期乳腺癌；此后又根据PALOMA3研究^［18］批准palbociclib联合氟维司群治疗绝经后既往内分泌治疗失败的ER /HER2^-晚期乳腺癌。Abemaciclib于2017年9月正式获得美国FDA批准上市^［19］。

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CDK4/6抑制剂治疗TNBC的基础研究

　　TNBC作为一种异质性的疾病，其内在丰富的生物学特性决定了对CDK4/6抑制剂的不同疗效。研究发现部分TNBC细胞株对palbociclib表现出一定程度的敏感性，甚至表现为明显的生长抑制，更有研究表明palbociclib疗效与ER或HER2的状态无直接相关^［20］。

2.1　CDK4/6抑制剂对TNBC的选择性作用

　　以往研究发现，Rb基因高表达的TNBC细胞株对CDK4/6抑制剂palbociclib敏感并阻滞于G₁期，Rb基因突变或低表达的TNBC细胞株则观察不到细胞周期阻滞现象^［21］。Liu等^［22］在TNBC研究中也证明在palbociclib治疗中，Rb与雄激素受体（androgen receptor，AR）表达状态都是不可或缺的。随后的临床回顾性研究也发现TNBC患者AR/Rb双强表达与总生存率显著相关，提出AR/Rb双阳性的TNBC患者适合palbociclib治疗。然而现有研究缺乏完整的临床数据来支持Rb和AR之间可能的相关性，关于AR和Rb在TNBC中的具体作用机制还不清楚，需要更深入研究来探讨两者的生物学联系。

　　Asghar等^［23］用palbociclib作用于12个Rb基因野生型的TNBC细胞系，发现TNBC中LAR对CDK4/6抑制剂表现出高度敏感性。Palbociclib敏感的LAR癌细胞通常在有丝分裂后进入CDK2低表达的静止状态，需要CDK4/6磷酸化Rb才可以通过细胞周期限制点^［6］；相反，部分基底样TNBC细胞经常进入CDK2高表达的增殖状态，不需要CDK4/6绕过该限制点，分裂时间更短，因此对palbociclib治疗具有耐药性。以往研究已经证明细胞周期蛋白E在促进CDK2高表达的同时，结合并激活CDK2，形成的复合物对CDK4/6抑制剂抵抗^［24］，这在一定程度上解释了基底样和潜在的许多其他TNBC类型对CDK4/6抑制具有的耐药性，也表明细胞周期蛋白E在RNA或蛋白水平上的表达有可能作为乳腺癌中CDK4/6耐药的预测生物标志物。

2.2　CDK4/6抑制剂联合抗雄激素治疗TNBC

　　恩杂鲁胺（enzalutamide）是第二代AR拮抗剂，相较第一代，对AR亲和力更高^［25］，已被美国FDA批准用于治疗晚期耐去势或耐化疗前列腺癌患者^［26］。除了前列腺癌，近年来的证据表明，enzalutamide对TNBC也有抗癌作用，这意味着靶向AR可能是TNBC的一种良好策略^［27］。在TNBC中，palbociclib联合enzalutamide可增强AR/Rb双阳性TNBC细胞的抑制作用，诱导细胞G₁期阻滞，而对其阴性的TNBC细胞抑制作用不明显^［22］。

　　越来越多的研究发现，enzalutamide联合palbociclib可有效阻滞AR/Rb双阳性TNBC的生长，提示AR和Rb的共表达可能是palbociclib联合enzalutamide联合治疗TNBC的生物标志物，为选择CDK4/6抑制剂联合AR拮抗剂治疗提供了依据。

2.3　CDK4/6抑制剂联合PI3Ka抑制剂治疗TNBC

　　在LAR和间充质干细胞亚型（mesenchymal stem-like，MSL）等非基底亚型TNBC中，富含PI3K催化亚基PIK3CA基因的激活突变^［28］。研究发现，PI3K抑制剂、mTOR抑制剂与palbociclib在PIK3CA突变的细胞系中都存在协同作用^{［23，29］}。与单一治疗相比，PI3Ka和CDK4/6双重阻断对多种Rb基因野生型TNBC模型的协同效应表现在抑制TNBC细胞糖代谢^［30］，显著增加TNBC细胞系的凋亡、周期阻滞、肿瘤免疫原性和产生免疫原性细胞死亡。在同源TNBC小鼠模型中，PI3Ka和CDK4/6联合抑制显著增加了肿瘤浸润T淋巴细胞的活化和细胞毒性^［31］。

　　进一步研究发现，PI3K抑制剂降低了有丝分裂后CDK2的活性，造成依赖CDK4/6活性来启动细胞周期的细胞内微环境。同时，药物抑制CDK4/6导致cyclin D1聚积并引发AKT信号上调，cyclin D1可以通过非经典途径激活CDK2^［32-33］。联合抑制CDK4/6活性和PI3K-AKT-mTOR轴可以防止有丝分裂上游信号上调导致的细胞反馈性增殖，为TNBC提供一种新的治疗思路，此类药物组合有可能进一步扩大对CDK4/6抑制敏感的亚型。

2.4　CDK4/6抑制剂联合免疫检查点抑制剂治疗TNBC

　　Goel等^［34］通过乳腺癌小鼠模型研究发现，CDK4/6抑制剂在诱导肿瘤细胞周期阻滞的同时，很大程度上促进了机体抗肿瘤免疫，表现为增强肿瘤抗原的呈现、细胞毒性T细胞识别和抑制负性免疫调节的T细胞增殖。在一项最新研究中，CDK4/6抑制剂体内可通过阻止cyclin D-CDK4介导的斑点型POZ蛋白磷酸化，提高PD-L1蛋白水平，揭示细胞周期激酶调控PD-L1蛋白稳定性的新分子机制，提出CDK4/6抑制剂联合PD-1/PD-L1免疫检查点阻断在提高人类癌症疗效的潜力^［35］，为CDK4/6抑制剂与免疫疗法作为抗癌治疗的新组合方案提供了理论依据。进一步研究发现，联合治疗组（PI3Ka抑制剂、CDK4/6抑制剂、抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体）在小鼠体内诱导建立的TNBC肿瘤中，显著增加肿瘤的免疫原性和T细胞毒性，使肿瘤消退有效且持久（>1年），总生存期明显优于其他治疗组^［31］。

2.5　CDK4/6抑制剂联合其他药物治疗TNBC

　　Foidart等^［36］研究发现，在膜4型基质金属蛋白酶、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）与Rb三者共表达的TNBC中，对CDK4/6抑制剂palbociclib与抗EGFR的erlotinib联合作用具有很强的敏感性，并提出三者生物标志物可以作为筛选CDK4/6抑制剂敏感的标志物。

　　现阶段，TNBC患者的主要治疗手段为DNA化疗，包含蒽环类、紫杉类和铂类药物等。Dean等^［37］研究表明，在Rb高表达的TNBC中，紫杉烷类和蒽环类药物的细胞毒性作用常与CDK4/6抑制剂的细胞周期抑制作用相拮抗，阻止DNA损伤和细胞死亡诱导；在Rb突变的TNBC中，palbociclib单药无明显作用，且联合化疗药物并不改善预后^［38］。CDK4/6抑制剂联合化疗在拮抗细胞毒性的同时，增加易出错的DNA修复机制，这可能有助于疾病的进展。

2.6　CDK4/6抑制剂在TNBC中的耐药机制

　　Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb-E2F信号通路功能的失调将直接影响CDK4/6抑制剂的疗效。结合CDK4/6抑制剂的作用机制和上文相关的基础实验，可以将TNBC的耐药机制归纳为：① 细胞内cyclin E-CDK2的富集^［23］，使细胞周期绕过依赖cyclin D-CDK4/6的限制点，而出现依赖于cyclin E-CDK2的增殖分裂，TNBC富含cyclin E1，CDK4/6抑制剂单药治疗的固有耐药性已被报道^［39-40］，而TNBC中的LAR存在分裂后cyclin E-CDK2低浓度而对CDK4/6抑制剂敏感。② Rb基因突变，30%的TNBC表现出Rb肿瘤抑制因子的功能丧失^［41］，导致下游E2F转录因子释放失控而耐药，此外，Rb mRNA低转录的细胞往往对CDK4/6抑制剂较不敏感^［40］。③ 细胞自身高表达抑制因子INK4家族，内源性抑制CDK4/6，在P16INK4a修饰后的乳腺癌模型中，palbociclib治疗对其无明显疗效^［33］，Rb和P16INK4a表达水平可联合预测乳腺癌患者对于CDK4/6的治疗反应。④ CDK6基因的扩增及细胞内高表达CCND1，使其信号通路高度活化而难以抑制。⑤ 其他基因的突变，包括异常的MYC癌基因、TP53^［42］、PDK1^［43］、FGFR1^［44］等，这些基因的变异均可导致对CDK4/6抑制剂敏感性降低。

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CDK4/6抑制剂治疗TNBC的临床研究

　　CDK4/6抑制剂palbociclib（PD0332991）和ribociclib（LEE011）联合内分泌治疗在晚期ER /HER2^-乳腺癌临床试验的突出疗效，已被美国FDA批准用于治疗此类患者^［10］。安全性分析结果显示^［45］，palbociclib试验组中性粒细胞减少、白细胞减少、贫血及乏力等不良反应发生率高。Abemaciclib常见的不良反应为消化道症状，如恶心、腹泻，另外还包括中性粒细胞减少、静脉血栓栓塞和肝损害^［19］。同时，基于CDK4/6抑制剂在TNBC相关的众多基础实验中取得的重大发现，近年来CDK4/6抑制剂在TNBC的临床试验也正在进行中（表1）。

　　目前，CDK4/6抑制剂在TNBC的临床试验，已经完成的仅有一项（NCT01037790），共入组4例Rb阳性的TNBC患者，经palbociclib单药治疗后，其中3例疾病进展（progressive disease，PD），1例疾病稳定（stable disease，SD）^［39］。在一项由Ruth O’Rega团队负责的Ⅰ/Ⅱ期非随机多中心研究（NCT03090165，2017年3月2日—2019年9月）中，CDK4/6抑制剂ribociclib（LEE011）与AR抑制剂比卡鲁胺（bicalutamide）联合治疗晚期AR阳性的TNBC。邵志敏教授团队下一项Ⅰb/Ⅱ期开放标签的综合性研究（NCT03805399，2018年7月17日—2022年6月1日），对CDK4/6抑制剂联合AR抑制剂治疗的患者，进行了更为精准的筛选，此类患者入组标准为Rb基因野生型、CCDN1扩增或CDKN2A拷贝数丢失的LAR。类似的临床试验还有，CDK4/6抑制剂trilaciclib（G1T28）治疗接受吉西他滨和卡铂化疗后转移性TNBC患者Ⅱ期研究（NCT02978716，2017年2月7日—2020年2月）以及palbociclib联合bicalutamide治疗AR阳性的转移性乳腺癌的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT02605486，2015年11月11日—2020年11月）和有关TNBC的Ⅱ期临床试验（NCT03519178，2018年7月—2021年12月）。这些临床试验的药代动力学结果、PFS、ORR、OS、CBR等值得我们期待。

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总结和展望

　　从现有的研究来看，CDK4/6抑制剂对肿瘤细胞的抑制作用，不仅局限于细胞周期的阻滞，还包括细胞凋亡的诱导、肿瘤细胞激酶信号的改变、免疫调节的变化及众多信号转导通路的改变，这使得CDK4/6抑制剂的应用和药物配伍也不断扩大。在TNBC中，CDK4/6抑制剂单用疗效十分有限，但其联合用药在增强药物疗效的同时，也扩大了受益人群，更彰显优势^［46］。在众多联合治疗方案中，CDK4/6抑制剂联合雄激素受体阻断可能成为TNBC中LAR的一种有效的选择性治疗，但仍需等待临床试验的验证。尽管目前palbociclib、ribociclib、abemaciclib这3种CDK4/6抑制剂在临床试验中疗效可观，但是现有的CDK6、CCND1、cyclin E-CDK2、INK4家族、Rb、激素受体等评估条件，除广泛认可的激素受体ER 外，与三者疗效相关的其他生物标志物尚无统一定论。因此，寻找CDK4/6抑制剂的疗效预测分子，指导合理的联合用药方案，挖掘潜在的TNBC患者，进一步实现个体精准化治疗，是未来努力的方向。

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