【原】C57小鼠海马神经元细胞原代分离培养

1、实验动物

新生24h 内清洁级C57小鼠若干

2、主要试剂

（1）B27

（2）DMEM-F12培养基

（3）Neurobasal A medium

（4）胎牛血清

（5）胰蛋白酶

（6）PBS

（7）青霉素-链霉素溶液（100X）

（8）DMSO

（9）L-多聚赖氨酸

（10）阿糖胞苷（Ara-C）

（11）L-谷氨酰胺

（12）台盼蓝

（13）多聚甲醛

（14）Aβ42

3、主要试剂配制

（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000mL，调pH7.2，121℃，30min高压灭菌，44℃冰箱保存。

（2）接种液的配制：按胎牛血清与DMEM-F12培养液体积比1：10，无菌条件下加入1%体积分数的双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。

（3）神经细胞维持培养液（无血清培养液）的制备 ：Neurobasal；2%B-27；1% 0.5mmol/L L-谷氨酰胺；1%青链霉素。换液前 3h 配制，置于4℃备用。

（4）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。

（5）阿糖胞苷溶液的制备：

a. Ara-C 储存液：称量 Ara-C 0.01g，溶于25mL去离子水中，即成 1.4mmol/L储备液。0.22μm 正压滤器过滤分装，置-20℃冰箱储存。

b. Ara-C 工作液： Ara-C储存液与无血清培养基以1:3 体积比配制成浓度为100µg/mL 的溶液。使用时按照培养液与100µg/mL的Ara-C体积比40:1 稀释，即Ara-C的工作浓度为2.5µg/mL。

（6）0.4%台盼蓝溶液的配制：台盼蓝4 g，PBS少许（研磨），PBS定容至100mL，滤纸过滤，室温保存。

（7）4%多聚甲醛的配制：多聚甲醛4g，PBS 100mL加热至 60℃，边滴加1mol/L NaOH边搅拌，至液体澄清。

（8）四噻唑兰溶液配制：MTT50mg，PBS10mL磁力搅拌30min，0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，2周有效。

4、实验步骤

（1）75%（体积分数）酒精消毒新生24h内的健康C57小鼠，在无菌条件下脱颈处死，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2，无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

（2）无菌分离海马组织。保持脑组织背面朝上，在镜下小心翻开大脑皮质，暴露海马，用眼科剪或尖镊分离海马周围组织，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

（3）用虹膜剪将组织剪切成1mm3左右的组织块，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期间振摇 2~3 次。

（4）弃去上清液，加入完全接种液终止消化，漂洗2次。巴斯德吸管轻轻吹打 20次，制成细胞悬液，静置 2min。

（5）悬液收集于新的离心管，离心（1000rpm，10 min，4℃），弃去上清液。加入完全培养液重悬，200 目不锈钢网过滤。

（6）将滤液进行台盼蓝拒染试验,血细胞计数板镜下计数。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度将细胞以400µL/孔接种到预先用L-多聚赖氨酸包被的24孔培养板或 100µL/孔接种 96 孔培养板。

（7）置 37℃、5%CO2培养箱培养 4-6h，全量更换为无血清培养液。

（8）体外培养第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神经细胞过度增殖，作用 24 h后吸出。

（9）此后每 3d半量换液1次 , 体外培养第 7～21d的细胞用于实验。

5、实验注意事项

（1）细胞接种前需用10mg/l的多聚赖氨酸包被培养板

（2）组织需多次分步消化，吹打细胞时不可用力太大

（3）需使用专有培养基培养

（4）阿糖胞苷使用时慎用，浓度太大容易引起细胞死亡

（5）细胞增殖力很弱，不适合传代；传代之后细胞损伤大贴壁少

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