【原】【干货】基因插入小鼠鉴定方法

针对大片段的基因敲入，F0代阳性鼠的鉴定分为三步。

第一步

在5’同源臂及3’同源臂设计引物测同源臂序列。设计两对引物，一对位于靠近5’同源臂的基因组及插入片段（5F和5R）上，一对位于靠近3’同源臂的基因组及插入片段（3F和3R）上。如果插入该片段成功的小鼠，其样本可以扩增出该片段，电泳结果有相应的条带；若插入失败，则扩增不出片段，电泳结果为没有条带。

第二步

验证是否发生了随机插入，即验证质粒上除了目的片段以外的其他片段是否随机插入到了基因组序列上，第一步验证出的阳性结果不能确定是否发生了随机插入。需要用一个阳性Donor（即插入了目的片段的Donor载体）作为对照，与第一步的验证类似，设计两对引物，一对引物位于质粒5’同源臂及载体的序列上，另一对引物位于质粒3’同源臂及载体的序列上。若是插入的片段包括质粒的其他部分，则电泳结果有目标大小的条带；若只插入了目的片段，则扩增不出来，电泳结果为没有条带

第三步

验证插入的片段的序列。如果插入的片段较小，则在插入片段两端设计引物，扩增电泳后切胶测序进行验证。

如果插入的片段过大，则需在插入的片段上分段设计引物去扩增，扩增后电泳，切胶测序进行验证。

需要注意的是，鉴于测序前后100bp左右测的不准，故R1,F2,R2,F3位置是交错的