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2020年3月11日，世界卫生组织认定COVID-19为全球大流行。截至2021年3月30日，SARS-CoV-2在全球已感染超过1.28亿人，并造成超过280万人死亡。SARS-CoV-2是一种冠状病毒，其向外突出的刺状蛋白（S蛋白）与人类呼吸内皮细胞表面的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合促进病毒进入。同时，病毒S蛋白也是单克隆抗体结合的主要抗原，并且每个SARS-CoV-2病毒大约含有100个S蛋白。目前，用于SARS-CoV-2的检测策略可分为两大类：分子检测和血清检测。其中分子检测主要使用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来扩增和检测患者样本（如痰液和鼻液）中的SARS-CoV-2 RNA。这个过程很昂贵且耗时长，并且需要实验室的处理。RT-PCR检测具有很高的灵敏度，其检测限（LOD）在1-10个病毒RNA拷贝之间。血清检测是检测患者血清中存在的IgG和IgM抗体，该方法只能提供过去病毒感染的监测数据而不能确定正在发生的病例。因此，通过分子检测的方法检测病毒RNA是目前诊断活性SARS-CoV-2病例的首选方法。然而，这一过程要求使用昂贵的设备和熟练的技术人员，限制了农村和低收入地区的检测能力。 近期，美国加州大学伯克利分校Markita P. Landry课题组开发了一种用于快速检测SARS-CoV-2的纳米生物传感器。该生物传感器利用ACE2蛋白作为识别单元，以单壁碳纳米管（SWCNTs）作为信号转导器，通过将ACE2蛋白固定在SWCNTs表面来构建纳米传感器，实现靶向的生物传感分析。这种非共价修饰的策略有利于保留SWCNTs完整的表面晶格。当S蛋白与ACE2功能化的SWCNTs结合时，SWCNTs的激子动力学发生变化，导致了近红外SWCNTs荧光调制的结果。研究表明，ACE2功能化的SWCNTs纳米传感器可以快速检测S蛋白和含有SARS-CoV-2的病毒样颗粒，并且对S蛋白受体结合结构域（S RBD）的LOD为12.6 nM。另外，还可以通过钝化处理该纳米生物传感器来检测唾液和病毒传播介质中的S蛋白。相关成果以“Rapid SARS-CoV-2 Spike Protein Detection by Carbon Nanotube-Based Near-Infrared Nanosensors”为题发表在权威杂志Nano Lett.上（DOI: 10.1021/acs.nanolett.1c00118）。
图一、ACE2功能化的SWCNTs纳米传感器工作示意图（左）；结合S蛋白后的荧光强度变化（右） （来源：Nano Lett.） 首先，作者构建并表征了纳米生物传感器ACE2-SWCNT。先将0.2 mg混合手性的SWCNTs与250 µM ssDNA鸟嘌呤-胸腺嘧啶(GT)6混合在1 mL的0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）中。该混合物经超声处理后，将悬浮液离心除去不溶沉淀物（SWCNTs和污染物），收集上清液得到(GT)6-SWCNTs的复合物。再将该复合物与ACE2蛋白（6.25 mg/L）在PBS中孵化形成ACE2-(GT)6-SWCNT复合物，从而使SWCNTs表面钝化。当ACE2吸附到(GT)6-SWCNTs上时，SWCNTs的荧光几乎瞬时猝灭。在5分钟内，复合体的标准化荧光变化值(ΔF/F0)减少了37%，并且这种荧光猝灭行为表现出良好的时间稳定性。另外，通过保留代表不同SWCNTs手性电子跃迁的吸收峰，证实了ACE2是通过非共价键吸附到(GT)6-SWCNTs上。
图二、ACE2蛋白吸附到(GT)6-SWCNTs上形成纳米传感器的结构示意图（左）；结合ACE2蛋白后荧光强度变化（右） （来源：Nano Lett.）
接着，作者分析了ACE2-SWCNTs纳米生物传感器对SARS-CoV-2 S RBD分析物的荧光响应。ACE2-SWCNTs纳米传感器检测浓度为10 mg/L的SARS-CoV-2 S RBD时，产生了强烈的荧光激活反应。在1130 nm下的SWCNTs发射峰的标准化荧光变化值（ΔF/F0）立即增加了21.1%，90分钟后达到了99.6%，并且加入PBS的影响基本可以忽略。作者进一步研究了S RBD浓度对纳米传感器检测的影响，测得其LOD值为12.6 nM。为了初步估计该纳米传感器的动力学参数，作者将90分钟内纳米传感器对一系列不同浓度分析物的响应通过Hill方程拟合。结果表明，纳米传感器的荧光变化与S RBD分析物的浓度相关，其平衡解离常数（Kd）为4.22 μM−1。另外，作者研究了ACE2-SWCNTs纳米传感器对一组病毒刺状蛋白的选择性。该病毒组由SARS-CoV-2 S RBD、SARS-CoV-1 S RBD、MERS S RBD和亚型流感血凝素蛋白（HA1）组成。对病毒蛋白按质量标准归一化（10 mg/L），结果在90分钟后1130 nm的波长下，SARS-CoV-2 S RBD SWCNTs的发射峰处产生了最大的荧光响应，ΔF/F0达到 99.6%；其次是SARS-CoV-1 S RBD，ΔF/F0达到了88.4%。MERS和HA1则产生低强度荧光响应。
图三、ACE2-SWCNTs纳米传感器对SARS-CoV-2刺突蛋白受体的荧光响应 （来源：Nano Lett.） 然后， 作者采用了一种钝化策略来减轻生物污染导致纳米传感器响应减弱的不利影响。通过在磷脂酰乙醇胺（PE）的端基上附着聚乙二醇链（PEG）形成PE-PEG复合物，再将该复合物吸附在SWCNTs上达到钝化纳米传感器的目的。在10%的病毒传播介质中，PE-PEG钝化的纳米传感器对500 nM CoV-2 S RBD的荧光响应ΔF/F0为19.9%，在1%唾液中ΔF/F0为12.4%。接着作者检测了钝化后的纳米传感器在不同体液中的选择性，结果表明PE-PEG钝化后的纳米传感器可以减少生物污染并且提高选择性。
图四、ACE2-SWCNTs纳米生物传感器在生物流体环境中的选择性和敏感性研究 （来源：Nano Lett.） 最后，作者将纳米生物传感器从溶液传感转换为表面固定的模式。ACE2-SWCNTs被固定在一个玻璃基底的微孔培养皿上，然后以100倍的油浸物镜成像。在60 s内PBS并未引起荧光信号的变化，当注射2 μM的 S RBD时，纳米传感器在5 s内的ΔF/F0为65.1%。在60 s时加入10%的蔗糖缓冲液（包含SARS-CoV-2结构蛋白、刺突蛋白、膜蛋白、核衣壳蛋白和包膜蛋白）后荧光基线略有增加。当注入35 mg/L的病毒样颗粒，纳米传感器在5 s内的ΔF/F0为72.8%。这个浓度的病毒样颗粒相当于大约17 nM的S RBD。
图五、表面固定化的ACE2-SWCNTs纳米传感器对SARS-CoV-2 S RBD和病毒样颗粒的荧光响应 （来源：Nano Lett.） 小结：美国加州大学伯克利分校Markita P. Landry课题组提出了一种基于SWCNTs光学传感快速检测SARS-CoV-2的方法。该传感器通过ACE2非共价功能化的SWCNTs构建而成。SARS-CoV-2刺突蛋白暴露后的90分钟内会引发纳米传感器2倍的荧光增强。作者表征了纳米传感器的稳定性和传感机制，并对纳米传感器进行钝化处理，使其在唾液和病毒传输介质中保持传感响应。作者通过实验证明，ACE2-SWCNTs纳米传感器以表面固定形式保持着传感响应能力，并且可以开发成快速检测SARS-CoV-2的工具。 |
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