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编译：元，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）统称为炎症性肠病（IBD），是一种特发性肠道炎症性疾病，是由环境、异常肠道微生物组、肠粘膜相关免疫系统、易感基因个体等多种因素相互作用的结果。随着新一代测序技术的发展，肠道微生物群在IBD发病机制中的作用被陆续揭示。但鲜有研究从不同微生物与黏膜的相互作用方面探讨微生物如何在IBD中起作用。IBD发病并没有显著且一致的特征性微生物组，但是越来越多的研究表明，肠道菌群失调在慢性肠道炎症的发病并过程中起了作用。靶向炎性细胞因子的生物制剂在临床上具有显著的疗效，细胞因子的作用是当下研究的热点。白细胞介素1（IL-1）有IL-1α和IL-1β两种类型，二者具有相似的生物学特性，但同时也存在差异，关于IL-1α和IL-1β在结肠炎小鼠模型中的作用的研究还很有限，目前还没有阻断任意一种IL-1的临床试验，在本研究中，研究者利用抗小鼠IL-1α的特异性单克隆抗体清除IL-1α，发现对减轻SAMP小鼠的炎症和损伤有显著效果。抗小鼠IL-1α能明显改善克罗恩病，并能保护小鼠免受DSS（葡聚糖硫酸钠）诱导的急性结肠炎。都与粪便肠道微生物群落的分类学差异有关，是特异性治疗，不依赖于炎症。抗IL-1α的给药降低了变形菌杆菌（Proteobacteria）与拟杆菌（Bacteroidetes）的比例，减少了螺旋杆菌的存在，提高了沙氏粘液性细菌（Mucispirillumschaedleri）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）含量。微生物区系上的改变在其功能上与IL-1α抗炎作用的削弱有关，阻断IL-1α对无菌SAMP小鼠无效。此外，用地塞米松对DSS诱导过的SAMP小鼠进行治疗，会使微生物区系结构发生改变，但不能阻止结肠炎的发展。因此，IL-1α的沉默改变了肠道微生物组的特定细菌种类，这与其抗炎作用有关。这些功能性发现可能对IBD患者具有重要价值，他们可能会受益于IL-1α靶向治疗。 原名：Neutralization of IL-1αameliorates Crohn’s disease-like ileitis by functional alterations of the gut microbiome 译名：IL-1α沉默可改变肠道微生物组的功能、改善克罗恩病 期刊：PNAS IF：9.58 发表时间：2019.12 通讯作者：Charles A. Dinarello1, Fabio Cominelli 作者单位：科罗拉多大学丹佛分校医学系；凯斯西储大学医学院医学系； 凯斯西储大学医学院消化健康研究所 试验以SPF级和GF级SAMP小鼠为实验动物，对SPF级试验动物进行粪便同质化（IsPreFeH）处理，以减少饲喂环境各种微生物所带来的干扰。小鼠腹腔注射抗IL-1α单克隆抗体（FLO1），并以注射地塞米松（Dex）为阳性对照组，以注射溶剂为空白对照组，研究首先对SAMP小鼠IL-1α和IL-1β的表达水平进行评估并加以验证后，对的GF级SAMP小鼠腹腔注射FLO1验证FLO1的拮抗活性后开展实验，采集血液、肠道组织、肠道内容物进行检测、观察、菌群分析。以饮用水中添加3%葡聚糖硫酸钠（DSS），在SAMP小鼠中诱导急性结肠炎，再次取样检测并分析，以死亡率、体重、TNFα、IL-1α、IL-1β、COX2等为检测指标。随后将经FLO1处理的小鼠的粪便微生物移植到GF级小鼠体内，重复实验操作取样检测并分析（如图2-A、图4-A、图6-A所示）。1. SAMP小鼠肠道IL-1α和IL-1β的高表达 研究评估了IL-1α和IL-1β在小鼠体内的表达量，并与其对照组（AKR）进行比较。回肠标本经SM分析SAMP小鼠（右）与AKR（左）小鼠相比，SAMP出现鹅卵石样肠粘膜异常（1A），与AKR组相比，SAMP组中IL-1α增多（1B），SAMP组回肠中IL-1β的转录水平，不论是涉及还是非涉及区域都显著高于AKR组，实验鼠回肠黏膜样本经24h培养后发现IL-1α和IL-1β的蛋白表达量均显著高于对照组。综上显示回肠炎易感型SAMP小鼠体内IL-1α和IL-1β有较高的表达水平，这表明IL-1在本试验小鼠模型中起到了重要的作用。
图1 SAMP小鼠显示肠道IL-1α和IL-1β的表达增加
2. IL-1α沉默对成年SAMP小鼠CD型肠炎的缓解 经FLO1处理组与空白组相比炎症积分显著增加，并且与Dex处理组相似（2B）。经重组同型对照抗体（IgG2ak）与空白组相比炎症积分没有差异（附图2）。随着病情的缓解，回肠组织外植体经24h培养后，其上清液中的促炎因子IL-1α和IL-1β的量与空白对照组相比，FLO1组和Dex组均显著下降（2C）。与空白对照组相比，FLO1组和Dex组中髓过氧化物酶（MPO）活性显著降低（2D）。由图2E可知，与对照组相比，经FLO1和Dex处理的小鼠的细胞浸润减少（红色箭头），上皮细胞完整保存（黑色箭头），粘膜肌层增厚减少（蓝色箭头）。综上表明IL-1α在回肠炎易感SAMP小鼠模型中起到了病理作用，对其的阻断可以改善病情严重程度。
图2 FLO1治疗对肠炎SAMP小鼠的缓解
附图2 IgG2ak同型抗体对CD型肠炎SAMP小鼠的影响
3. FLO1治疗对SPF级SAMP小鼠的粪便微生物组有显著的再生作用 数据显示了两个独立实验（附图3A、3B）中不同类群中唯一和普通（核心）OTU分类物种的数量。三组之间的微生物组分在两个独立实验中是一致的、可重复的，微生物群改变的处理效果再现性明显（附图3C）。但在两个单独的实验中未发现与IL-1或Dex依赖效应显著相关的复合微生物物种。这些结果表明，FLO1处理会引起肠道微生物群的整体改变。然而，抗IL-1α治疗是否直接调节肠道菌群或通过减少肠道炎症达到这种结果尚待确定。
附图3 FLO1与Dex治疗前后细菌群落结构的变化
4. 阻断IL-1α后不能从GF级SAMP小鼠体内检测到抗炎效果 40周龄的GF级SAMP小鼠与SPF级SAMP小鼠的回肠三维结构炎症表型相似（3A），研究者使用免疫荧光共焦显微镜首次验证了GF级SAMP小鼠体内有IL-1α（3B），然后确定GF级和SPF级SAMP小鼠回肠中IL-1α mRNA表达量是相近的（3C）。用FLO1对GF级SAMP小鼠进行处理，并设置对照组，发现IL-1α阻断后GF级SAMP小鼠不能表现出像SPF级SAMP小鼠那样的抗炎变化，说明IL-1α的抵消对肠道微生物有重要作用。GF级SAMP小鼠的炎症积数、MPO活性，在处理组和对照组之间差别不大（3D），这些数据表明，IL-1α不仅参与了肠道炎症的发病机制，而且IL-1介导的肠道微生物组分变化可能对IL-1α抗炎作用有重要作用。
图3 GF级SAMP小鼠经FLO1处理无明显抗炎效果
5. 经FLO1预处理的SPF级SAMP青年小鼠可避免DSS诱导的结肠炎。 与对照组和Dex组相比，经过FLO1处理的小鼠暴露于DSS后其死亡率有所下降（4C），小鼠的初始体重减少量更少（4B），结肠样本中测定的MPO活性显著降低(图4D)。经组织学分析，FLO1预处理可有效地保护SAMP幼鼠免受DSS诱导的结肠炎（4E、4F）。以COX-2为炎症标记物评估试验动物结肠组织中mRNA的表达量，FLO1组COX-2表达量显著低于其他两组，IL-18可以提升肠道屏障的完整性，其在FLO1组中表达量也相对较高（4G）。综上可知FLO1治疗可引起微生物区系改变，这种改变与炎症无关，但微生物组的功能明显受IL-1α阻断影响。
图4 用FLO1预处理SPF级SAMP青年小鼠可避免其随后受DSS诱导的结肠炎
6. IL-1α沉默改变了青年SPF级SAMP小鼠肠道细菌的组成 经IsPreFeH处理后（5B）或经FLO1和Dex处理后（5C），与实验前笼-笼间的差异相比，所有实验组有着相似的微生物群落（5A），但经DSS诱导后使肠道菌群的组成发生了显著的变化（5D），在FLO1处理后的PCA分析中（附图3C）得出的结果与图5D相似。经过FLO1处理的小鼠门水平上的拟杆菌门(Bacteroidetes)更丰富，而经过控制和Dex处理的小鼠门水平上的拟杆菌门(Firmicutes)和变形杆菌门(Proteobacteria)更丰富（5E）。在目水平上，与空白对照组和Dex处理组相比，经FLO1和Dex处理的两组乳酸菌（Lactobacillales）数量较多，弯曲杆菌（Campylobacterales）数量减少。与对照组和经Dex处理的小鼠相比，经flo1处理的SAMP几乎检测不到脱铁杆菌（Deferribacterales）和梭菌（Clostridiales），相反，拟杆菌（Bacteroidales）菌群更为丰富。在属水平上，与对照组相比，经FLO1处理的小鼠中乳酸菌（Lactobacillaceae）和普雷沃氏菌（Prevotellaceae）的数量增加，而对照组中毛螺菌科（Lachnospiraceae）和脱铁杆菌科（Deferribacteraceae）的数量要高于FLO1和Dex处理组，在对照组和Dex处理组中发现了螺旋杆菌科（Helicobacteraceae）细菌，而在FLO1组中，Helicobacteraceae数量明显减少。
图5 FLO1处理可调节4周龄SAMP小鼠的细菌组成，
对照组、Dex组、FLO1组中小鼠粪便微生物群分布的UniFrac分析MDS图 7. 细菌种类鉴别可预测IL-1α沉默 分析（附表1）显示Mucispirillumschaedleri与Ruminococcusgnavus、Helicobacterhepaticus呈正相关，Lactobacillussalivarius与Lactococcusgarvieae、H. hepaticus呈负相关，在Parabacteroidesdistasonis、R. gnavus、L. salivarius之间存在显著的负相关性。附表1展示了最重要的关系和调整的显著意义，表明识别物种的潜能可预测IL-1α治疗反应。分析（附表2）显示，与其他两组相比，FLO1组的小鼠发生了显著的治疗相关变化：M.schaedleri和L.salivarius显著增加，与对照组相比，这类菌具有更高的的相对风险比(RRR)。与Dex组相比，这类菌在FLO1组中具有更高的RRR，而L. salivarius的RRR不显著。与对照组和Dex组相比，FLO1组中H. hepaticus被显著抑制。经Dex处理后R. gnavus明显减少，FLO1处理后也有一定程度的减少。与对照组和Dex组相比，Ruminococcus flavefaciens在FLO1组中RRR更高。这些结果表明在非炎症SAMP小鼠体内IL-1α沉默直接改变肠道微生物组组成、形成了抗炎的微生物组。
附表1相关细菌之间的多元线性回归系数
附表2多类逻辑预测模型：IL-1α沉默和特征性细菌种类之间的相对风险比（RRR）和预测关系
8. 将FLO1组SAMP小鼠的粪便微生物移植到GF级SAMP小鼠体内，可改善经DSS诱导的结肠炎。 和移植了对照组或Dex组菌群的小鼠相比，经DSS诱导后，移植了FLO1组菌群的小鼠死亡率降低（6B），体重减少量降低（6C）。经组织学分析，移植FLO1组菌群的小鼠，结肠炎症得到缓解（6D、6E）。炎症因子mRNA表达量标记物（TNFα、IL-1α、IL-1β、COX2）与其他两组相比显著降低（6F）。结果表明，FLO1菌群移植到GF中SAMP小鼠对dss诱导的结肠炎有抵御功能。
图6 GF级SAMP小鼠从经FLO1处理过的SAMP供体获得微生物群后显示DSS诱导的结肠炎减弱
在自发性回肠炎（左）和实验性DSS诱发的结肠炎（右）期间，受损的肠上皮细胞（IEC）释放大量IL-1α，而IL-1α又诱导IL-1β、Cox2、MPO等炎症介质表达，引发疾病、肠道微生态稳态失调、肠上皮屏障作用被破坏。用抗IL-1α鼠源特异性单克隆抗体（FLO1 m Ab）阻断IL-1α后，回肠炎和结肠炎的严重程度显著降低，同时炎症标记物（IL-1α，IL-1β，MPO，Cox2）和IL-18的水平升高，IL-18是肠道屏障完整性的诱导剂。并且，IL-1α沉默与微生物群落结构的变化有关，使益生菌有较高的丰富度，这对于那些寄希望于IL-1α治疗的患者来说，可能具有实践意义。
图7 抗IL-1α在慢性肠道炎症中的影响
这项研究显示IL-1α在肠道微生物组功能中具有独特的调节作用，进一步扩展了我们对IL-1α在黏膜免疫中的作用的认识，为IL-1α在实验性IBD发病机制提供了重要的数据支持。该项研究结果揭示了IL-1α沉默对IBD患者的治疗潜力。IL-1α沉默后IBD患者的肠道微生物生态系统将会发生调整并发挥其抗炎作用，从而改善IBD的粘膜营养失调。但还需要进一步研究来确定哪些菌株可以在功能上介导IBD中抗IL-1α治法的抗炎作用，以及受影响的潜在免疫途径。此类细菌-宿主间的相互作用若能进一步揭示，将会为受这些菌群失衡患者提供新的和有针对性的治疗途径，同时也为研究者提供了思路。
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