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编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 人为环境与抗生素抗性基因和细菌的富集与交换密切相关。本研究中，我们探究了在为期3个月的有限且受控制的养猪场环境暴露，对兽医专业学生肠道微生物菌群和抗生素耐药性的时间性变化的影响。基于16S rRNA和全基因组测序，结合培养学方法，本研究发现，农场暴露塑造了学生的肠道微生物群，导致潜在致病类群和抗菌素耐药基因的富集。通过对学生的肠道微生物群和耐药性与其在农场工作的工人和环境样本中的进行对比发现，在接触和访问三个月后，耐药性基因和细菌的广泛共享。值得注意的是，在学生样本和农场环境样本中发现了类似的遗传背景下的抗生素耐药性基因。动态Bayesian网络建模预测我们观察到的变化在4-6个月内出现部分逆转。基于我们的结果表明，人类生活环境的急剧变化可以持续地塑造人类的肠道微生物菌群和抗生素耐药性。 论文ID 原名：Environmental remodeling of human gut microbiota and antibiotic resistome in livestock farms 译名：畜禽养殖场环境重塑了人类肠道微生物和抗生素耐药性 期刊：Nature communications IF：11.878 发表时间：2020年3月18日 通讯作者：Gautam Dantas，刘雅红 通讯作者单位：华盛顿大学圣路易斯医学院（Washington Universityin St. Louis School of Medicine），华南农业大学 实验设计 样本收集 学生粪便样本按以下时间节点进行采集：在进入猪场前1-2周（记为T0），连续3个月内每周采集一次（记为T1-T3）、返回后每月连续3个月进行采集（记为T4-T6）。学生在猪场停留期间，每月对所招募的工人志愿者的粪便进行样本采集，同时，在此期间在每个猪场平均每月采集猪粪40份、土壤3份、污水3份、通风粉尘3份。用于随后的测序等一系列分析。 结果 1 肠道微生物菌群的变化与环境暴露有关 我们对14名学生纵向采集的91份粪便样本进行了16S rRNA基因测序，以描述肠道微生物群落结构随环境变化的时间模式（T0、T1-T3和T4-T6；图1a）。基于OTU组成的多变量分析显示，从到达猪场（T0）到离开养猪场的这段时间里，研究参与者的肠道微生物群落发生了适度但显著的变化（R2=7.4%，P<0.001）（图1b）。这一变化发生在学生到达养猪场的1个月内（T1）。离开养猪场三个月后（T6），学生的肠道微生物菌群部分恢复到原来的微生物组成。值得注意的是，学生的肠道微生物菌群在所有三个农场都发生了类似的变化，这一结果反映了尽管地理上分离，但农场生态环境之间可能存在共性。养猪场居住期间，受试者肠道微生物菌群的微生物多样性（α多样性）没有显著差异（图1C）。但在特定微生物类群上，学生在进入养猪场前与养猪场居住期间存在明显的偏差。其中Bacteroidetes（人体肠道中对膳食碳水化合物新陈代谢和维生素生物合成有贡献的主要共生体）有所减少，Proteobacteria有所增加（特别是包括许多人类病原体的Gammaproteobacteria），同时Faecalibacterium属，Collinsella属，Blautia属以及Veillonellaceae科在内的微生物的相对丰度表现出显著变化。 通过对42份学生在T0、T3和T6时间点的粪便样本和每个猪场3名专职工人的粪便样本进行了全基因组鸟枪法测序（WGS），我们探究了学生肠道菌群的变化程度。基于冗余分析我们发现，T3时学生肠道微生物菌群明显偏离于T0时间点，但与猪场工人的微生物菌群相似。这表明，学生肠道微生物菌群的变化与其在养猪场环境中的工作与来访相关。与T0和T6样本相比，T0和T3样本之间的Bray-Curtis差异明显更高，这支持了我们上述的想法。为了减少时间依赖性混杂因素的潜在影响，我们将参与者的肠道微生物群与从中国城市环境中收集的196名不同季节的中国城市受试者的基线健康队列进行了比较。我们的结果进一步表明，T3采集与对照组的差异明显大于T0或T6时间点的样本。由于许多环境因素，包括饮食、抗生素和地理因素，因此很难从农场环境的单独因素中确定具体的贡献。然而，尽管个体寄主和地理位置不同，我们在所有学生中观察到了相同的微生物群落转移趋势，这反映了基于16S rRNA基因的分析的分类趋势。这些结果表明，来自不同地理位置的养猪场上的多种保守环境因素对肠道微生物菌群的塑造表现出一致性。 2 抗生素耐药结构受环境变化的影响 为了评价抗生素抗性（AR）基因的变化是否伴随着微生物的变化，我们对学生的肠道耐药性进行了宏基因组学分析。其中我们共鉴定出1924个非冗余的AR基因。这些基因编码一系列AR酶，其中β-内酰胺酶（44.4%）、氨基糖苷类耐药蛋白（17.5%）和氯霉素乙酰转移酶（15.2%）为主要AR类型。 基于定制的AR基因数据库，我们通过ShortBRED方法量化了学生样本中AR基因的丰度，同时我们用宏基因组组装鉴定了AR基因。此外，来访学生的肠道耐药性的变化与全职工人的肠道耐药性的变化具有差异性。但类似于肠道微生物菌群的变化，在猪场停留期间。学生的肠道耐药性在不同时间之间具有微小的差异（图2a）。Procrstes分析证实抗生素耐药性与群落组成显著相关（图2b）。尽管相对丰度平均增加了3.7%，但在猪场驻留期间获得的样本中检测到的AR基因的数量和丰度没有显著性变化（图2C）。 3 微生物从猪场环境转移到学生肠道 为了评估学生肠道微生物群和抗生素耐药性的变化是否与生活在猪场环境下有关，我们通过四个有代表性的指标：通风系统粉尘、猪粪、污水以及堆肥土壤来探究猪场生态系统的微生物景观。对每个猪场采集的环境样本进行合并（每个环境包含3-5个采样点），并进行宏基因组鸟枪法测序分析（WGS）。与人类肠道微生物群相比，环境样品中具有较高的微生物分类和AR基因多样性。通过对比学生志愿者在猪场入驻前和入驻期间的肠道菌群可以发现，学生进入猪场后其肠道内发现的新基因比例较高（平均增加42%）。其中近三分之二的基因也存在于环境样本中（图3a）。由于基因可以通过宿主细菌传递或水平基因转移，我们试图将基因交换结果与学生在猪场停留期间的OTU组成变化进行关联。OTU组成变化与基因交换之间的强烈关联表明环境和人类肠道之间存在广泛的微生物传递。基于SourceTracker算法，我们对新获得基因的分类分配和丰度水平进行了整合分析，从不同的养猪场环境到学生的肠道微生物菌群的传播中，我们共鉴定出142种传播事件，其中猪粪和土壤是主要的细菌来源（图3b）。这些传播事件包括不同的Firmicutes以及Proteobacteria，其中一些（如Ruminococcus spp.，Escherichia spp.以及Pseudomonasputida）是导致人畜共患感染的致病菌株。这些常见致病物种的传播表明，我们在工业化养殖过程中常常低估了土壤和猪粪所带来的的职业危害。为了探究这些物种及其基因是否是从环境中获得，我们对这些从学生和环境微生物群中鉴定出来的物种进行了比较基因组分析。我们从学生的肠道微生物菌群中重建了9个高丰度物种的基因组（包括在人类肠道中很少观察到的Phascolarctobacterium succinatutens），而这些基因组存在于相应的环境样本中。这些基因组与它们各自的环境衍生基因组的16S rRNA基因同源性为99.9±0.1%（最低99.7%），平均核苷酸同源性（ANI）为99.5±0.4%（最低98.9%），这些结果表明它们在学生肠道及其周围环境中共享相同细菌克隆。 为了进一步研究微生物在学生和农场环境/工人之间的传播，我们从学生、农场工人和一个养猪场中采集的环境样品中分离到82株E.coli，并对其进行了遗传相关性的培养和鉴定。我们发现E. coli在学生、农场工人和农场环境之间克隆传播的多个事件。总的来说，非培养的粪便宏基因组分析以及基于培养的环境细菌克隆分析的结果表明，学生的肠道微生物群和农场环境之间发生了广泛的物种传播，这其中不乏包括致病微生物的传播。 4 猪场环境与人类肠道之间AR基因的转移 环境代表着一个巨大的抗药性细菌和AR基因的储存库，其与人类之间的传播令人担忧。在本研究的数据集中，我们发现了人与环境微生物群落之间广泛的AR基因共享网络，并进一步揭示了在农场的学生肠道微生物菌群中检测到的25%（477/1924）的AR基因同样可以定位到农场环境中的可遗传因子中（MGEs），这些MGEs经常参与AR的跨环境转移。基于SourceTracker算法，我们鉴定了270个AR基因，这些基因参与了从猪场环境传播到学生肠道生境这一过程。猪粪和污水是抗药性细菌和AR基因的主要来源，这些来源的传播事件几乎包括所有类型的AR基因，而土壤主要涉及编码氨基糖苷类失活酶的AR基因的转移。 为了进一步将抗药性AR基因的出现与其在养猪场环境中的存在相联系，我们鉴定了120个相关的AR基因。这些基因包括超广谱β-内酰胺酶（包括blaTEM和blaCTX-M）、质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrS和替环素耐药基因tet（X）。这些AR基因在猪场逗留期间或之后在学生的肠道中有所富集（图4a）。为了了解这些AR基因的交换潜力，我们探究了组装重叠群中的flanking genetic sequences。在人类肠道以及环境微生物的两个生境中，41%（49/120）的编码基因具有相似的遗传背景，其中许多基因与MGEs有关（包括几种广谱β-内酰胺酶，tet（X）和qnrS；blaCTX-M作为代表如图4b所示）。这为人类肠道和猪场环境微生物菌群共享重要的AR细菌和AR基因提供了证据。 为了进一步了解学生在农场逗留期间AR基因和表型AR的获得情况，我们从所有样品中分离到1851株E.coli。表型耐药试验显示，与初始状态（T0）相比，在不同时间下（T1、T2、T3），从学生样本中分离的E. coli对包括头孢噻肟、环丙沙星、磷霉素在内的9种抗生素的耐药率随时间的延长而增加。而在T4、T5和T6时间点的学生样本中的E. coli保持了较高的耐药率水平。这与宏基因组分析一致，即T6的抗性组没有随着微生物菌群向T0移动，而是保持了较高的AR基因丰度。值得注意的是，来自农场样本（包括农场工人、猪和环境样本）的E. coli对这些药物的耐药率相对较高。与这些表型AR结果一致的是，在T2-T4期间，在学生分离的E. coli中，由可转移质粒介导的包括blaCTX-M（赋予第三代头孢菌素抗性）和fosA3（赋予磷霉素抗性）在内的AR基因的检出率也高于T0，但在T4-T6期间下降（图4c，d）。这些结果表明，猪场环境可能通过AR E. coli分离株的传播或AR基因转移导致人共生E. coli分离株抗生素抗性基因的增加。 5 预测环境引起的变化对肠道微生物群落结构的影响 为了预测环境变化对肠道微生物群落结构影响的持久时间，基于从学生粪便样本中获得的7个时间点的16S测序数据，建立了相对分类丰度的时间序列模型。我们利用扩展局部相似性分析将微生物相互作用进行建模，以捕获微生物分类群之间的局部和潜在时间延时的共现和关联模式。对推算出的群落结构的分析表明，学生的肠道微生物群很可能在返回初始环境后的4-6个月内恢复到原来的状态（图5）。分类群落结构的变化在6-9个月的范围内并趋于稳定。由于肠道抵耐药性和肠道微生物菌群的系统发育组成似乎紧密相连，我们还发现在终止暴露于养猪场环境后，学生肠道耐药性发生了逆转。然而，在经过3个月的恢复期后，一些与临床相关的AR基因仍可被检测数。为了阐明这一现象，需要对人体肠道微生物菌群和耐药性的环境塑造以及随后的恢复进行更广泛的纵向研究。 讨论
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