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编译：北越城主，编辑：谢衣、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 热量限制（CR）对健康和生存的影响是复杂的，并且其潜在的分子机制尚不了解。最近一项针对小鼠饮食CR的研究中发现，尽管饮食组成不会影响寿命，但空腹时间和总卡路里摄入量是提高存活率的关键性因素。在本文中，作者通过对自由进食，定时喂养和CR饮食动物的生理和多组学数据进行综合分析，以便深入了解与改善健康和生存相关的一些因素。研究结果发现甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢轴在长寿及相关分子机制中具有潜在的作用影响。对不同喂养方式的直接比较揭示了改善健康的共享途径的模式，其中包括短链脂肪酸和必需的多不饱和脂肪酸代谢。而且在非人灵长类动物的血清代谢组中重现了这些发现。 论文ID 原名：Untangling Determinants of Enhanced Health and Lifespan through a Multi-omics Approach in Mice 译名：通过多组学研究方法探究小鼠增强健康和寿命的关键性因素 期刊：Cell Metabolism IF：21.567 发表时间：2020.05.14 通讯作者：Rafael de Cabo 通讯作者单位：美国国立卫生研究院（NIH） 实验设计 实验结果 为了更好地研究饮食组成和喂养方式对生理结果的影响，我们在先前描述的同一研究中进行了一系列纵向测量（图1A）。简而言之，将292只4个月大的雄性C57BL / 6J小鼠在随机分为NIA和WIS 两种进食模式下的自由进食（AL），一日一餐定时喂养（MF）和CR饮食方案饮食组。CR和MF小鼠在每天下午3:00接受单餐。通过核磁共振（NMR）评估的身体成分表明，在治疗的前2年中，两种饮食类型的CR小鼠体内的脂肪百分比均显着低于AL组（图1B，上图）。无论饮食组成如何，MF小鼠与AL小鼠总脂肪含量相似都没有区别。MF和AL小鼠的计算的肥瘦比率重叠至24个月大，与不依赖饮食的CR小鼠相比明显更低（图1B，下图）。 经过一夜禁食（16小时）后，两种饮食下所有小鼠的的禁食血糖（FBG）水平相对稳定，在WIS饮食下，FBG水平略高（图1C）。为了确定这些组在FBG轨迹中的变化是否反映了葡萄糖稳态的差异，我们对10和14个月大的禁食16h小鼠进行了口服葡萄糖耐量测试（OGTT）。对于每种饮食，CR小鼠的葡萄糖清除率均高于AL（图1D）。与使用WIS-AL或WIS-CR的小鼠相比，WIS-MF小鼠的葡萄糖清除速率较慢，而对于NIA饮食，AL和MF在很大程度上是相同的。小鼠在CR上的肝脏代谢组学显示β-羟基丁酸的积累。对于这项工作中使用的队列研究，我们报道了CR条件下血清β-羟基丁酸水平升高，但在MF条件下没有升高，尽管MF小鼠每天禁食10小时左右。 使用全面的实验室动物监测系统（CLAMS），通过呼吸测定法在10个月大的小鼠的三个明/暗周期中连续监测体内代谢节律。AL小鼠昼夜呼吸交换率（RER）节律较弱，可能是由于缺乏明确的禁食期所致。相反，在两种饮食类型下，MF和CR小鼠的昼夜节律性均明显。RER约为0.75，这表明其对脂肪酸（FA）氧化的代谢依赖性更高，并且在禁食（光照期）期间在饮食和喂养方案中均观察到RER。餐后阶段的RER为1.0或更高，表明主要为碳水化合物加油（暗期）（图1E）。如预期的那样，MF和CR小鼠发生的O2消耗，CO2产生，移动（以活动计数表）和生热的节律性与明暗循环和RER模式同步。总之，这些结果表明，与CR相比，小鼠的身体成分和葡萄糖稳态对MF表现出不同的响应；尤其是在NIA饮食时，与AL相比，MF和CR小鼠的代谢状况都发生了显着改变，而与饮食的组成无关。 2 饮食构成和喂养方式对肝转录组和代谢组学影响 MF和CR喂养均对健康和生存产生有益影响，包括脂肪肝疾病和肝癌的延迟发作。为了深入了解其基础生物学，我们对从ALA，MF或CR喂养NIA或WIS饮食20个月的24个月大小鼠制备的总肝样品进行了分子机制研究。在进行cDNA微阵列分析的总RNA样品中确定转录情况。同时，对来自同一组小鼠的肝脏进行了非靶标代谢组学。通过饮食分开，转录组学数据（18,120个独特的转录本）的主成分分析（PCA）显示了不同喂养模式的（NIA / WIS饮食：AL [n = 6/5]，MF [n = 6/5]和 CR [n = 8/8]）（图2A）。通过偏最小二乘判别分析（PLSDA），交叉验证的多元监督聚类的分类方法，在两种饮食中均显示出AL和CR之间的明显分离，但MF组与AL的重叠更大，尤其是在WIS饮食中（NIA / WIS饮食：AL [ n = 6/6]，MF [n = 6/6]和CR [n = 8/8]）（图2B）。 接下来，我们采用了一种结合生物信息学的分析方法来剖析途径。如韦恩图所示（图2C），在转录组和代谢组数据中均发现了通过进食范例改变但与饮食无关的共享基因和代谢物。从最初3,770个显着变化的转录本列表CR-AL和MF-AL成对比较分别鉴定了1,926和1,032个独特的转录基因。代谢组数据的类似比较确定了总共155种显着变化的代谢产物，其中CR-AL和MF-AL比较分别具有39种和43种独特的代谢产物（图2C）。使用MetaboAnalyst 3.0中的JPA模块作为多组学分析的输入。JPA允许从转录组学和代谢组学数据的组合中进行功能富集和途径拓扑分析。对于每种范例，“特定”途径占排名最高的20个新陈代谢过程的60％（图2D和2E）。CR特定的途径包括排毒，维持分子更新和提供能量（图2D，右图）。除了糖鞘脂合成，FA和碳水化合物代谢外，其中还包括细胞色素P450代谢途径，与氧化还原和氧化应激有关的途径（如谷胱甘肽和烟酰胺代谢）以及叶酸循环。MF途径集中于氨基酸，FA和蛋白质前体（嘌呤和嘧啶）合成的中央分解代谢和合成代谢途径（图2E）。除嘌呤和嘧啶的合成外，还明显地涉及了三羧酸（TCA）循环，酮体，FA和丙酮酸的主要代谢途径（图2E，右图）。这些数据表明，相对于AL，CR赋予寿命的增加涉及适应、参与解毒的肝保护机制并维持氧化还原平衡。 3 甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢的一碳，蛋氨酸和硫合成途径是生命的主要途径 为了深入了解有助于延长寿命相关的途径，我们寻找与AL不同的而对CR和MF有共同反应的因素，但这些因素与饮食和喂养范例无关。CR和MF之间共有21个基因和10种代谢物的“核心”子集（图3A）。肝脏和血清中代谢物水平的双向方差分析使我们能够区分单独喂养方式，单独饮食或“喂养3种饮食”相互作用的影响。最富集的途径是氨酰基t-RNA生物合成。甘氨酸（Gly），丝氨酸（Ser）和苏氨酸（Thr），谷胱甘肽，牛磺酸-亚牛磺酸和半胱氨酸-蛋氨酸的代谢途径是根据富集分数中排名最高的与分解代谢和氧化还原相关的途径（图3B）。Gly-Ser-Thr之间的相互作用代表了一条重要的代谢十字路口，与几种高度重要的生物学途径相关（图3C和3D）。Gly-Ser-Thr可通过两种酶（丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）和苏氨酸醛缩酶）的作用可逆地相互转化（图3C）。Ser参与硫（蛋氨酸和半胱氨酸，牛磺酸和亚牛磺酸）的代谢，并有助于膜磷脂主要成分的生物合成。有趣的是，糖鞘脂和甘油磷脂代谢也在最重要的途径中。Ser是与甲硫氨酸循环直接相关的核苷酸合成的一个碳库的来源（图3D）。半胱氨酸和谷胱甘肽途径在“核心”网络中也很丰富，可能与也在其中丰富的甘氨酸和谷氨酸途径有关。 为了验证我们的发现，研究了来自Gly-Ser-Thr代谢枢纽的关键基因和酶的表达水平。我们分别使用实时PCR和免疫印迹，验证了有关蛋氨酸循环转硫（Cbs和Gst2），细胞色素P450相关解毒（Cyp3a11）和脂质去饱和（Fads2）途径的酶编码基因的肝脏微阵列结果。发现了微阵列和实时PCR数据之间趋势模式的总体半定量一致性。值得注意的是，两种饮食中CR组的谷胱甘肽S-转移酶2（Gstt2）基因表达水平显着增加。关于AL-MF-CR序列，GIA1/2的蛋白质丰度在NIA（减少）与WIS（增加）饮食中呈相反趋势。SHMT1在NIA中表现出相似的下降模式，而WIS中的胱硫醚β合酶（CBS）上升，两种饮食中的MAT1A均未改变。 总体而言，在CR和MF喂养范例的基础上，我们发现了以Gly-Ser-Thr代谢为中心的常见的长寿相关途径。空腹与提高生存率之间的明确联系与排毒和维持分子代谢，修复/维持和合成的生命维持机制密切相关，这些机制在保护肝功能方面至关重要。 4 参与MF和CR反应的肝脏代谢途径 两种饮食都显示出CR寿命更长，并且都可以调节“核心”途径。接下来，我们采用了另一种方法来了解肝对MF和CR方案反应的生物学原理。在这里，我们没有使用AL作为参考，而是确定了每种喂养方案（AL，MF和CR）的NIA和WIS应答转录组和代谢组，然后寻找特定于每种方案或在每种方案之间共享的特征（图4A）。首先，通过在NIA上对WIS中差异丰富的物种进行分类来确定转录基因和代谢产物的饮食依赖性富集。我们针对这三种方案中的每一种分别进行了JPA分析，根据富集和拓扑结构对前20条途径进行了排名（图4B）。在喂养方案中，共有六个途径被确定为常见的（洋红色箭头），包括细胞色素P450介导的异源生物和药物代谢，谷胱甘肽代谢，亚油酸代谢，TCA循环和FA延长。这些途径的保守与其在肝功能中的关键作用相一致。但是，这六个共享途径的分布和突出程度似乎根据喂养方案而有所不同。这些常见途径在喂养方案中的排名不同；这一事实表明，根据喂养行为，这些途径的参与方式可能有所不同。黑色箭头指示的另一套途径特定于一种方案或另一种方案（图4B）。MF喂养促进了一系列独特的途径，包括脂质（FA生物合成），核酸（嘧啶）和碳水化合物（糖酵解-糖异生，半乳糖）代谢。此外，MF引起的通路涉及氧化还原相关（磷酸戊糖）和抗生素氨基糖苷（布特罗霉素-新霉素）的代谢。 MF和CR均检测到叶酸代谢，但在CR排名中更显着。CR与紧密相关的路径模式相关，该路径模式由支链氨基酸（BCAA）降解， SCFAs（丁酸和丙酸），FA代谢，酮体合成和降解以及碳水化合物互相转换（戊糖，葡萄糖醛酸）组成。由于丙酸和丁酸的主要来源是大肠菌群对膳食纤维的发酵作用，因此它们的存在表明肠道细菌的参与。通过丙酰辅酶A羧化酶（PCC）的催化，丙酰辅酶A被羧化以产生甲基丙二酰辅酶A，其通过琥珀酰辅酶A进入TCA循环（图4C）。丙酸代谢与线粒体代谢（BCAA，FA和酮体降解）之间的联系是由胆固醇，缬氨酸，支链FA，蛋氨酸，异亮氨酸和苏氨酸的分解代谢产生的（图4C）。在CR治疗小鼠的肝脏中，苏氨酸，异亮氨酸，缬氨酸和亮氨酸的氨基酸含量显着降低。总之，与MF和AL相比，这些途径都表明CR小鼠肝脏中的动脉硬化加剧。在饮食和喂养方案的功能中观察到与胆固醇生物合成有关的代谢产物丰度的变化。在PCCB（编码PCC的基因之一）和GTP结合蛋白的转录水平上也检测到了显着差异。 然后，我们使用维恩图来确定三种喂养方案中常见的基因和代谢产物与饮食组成无关（图4A）。发现了41个转录物和14个代谢物的子集，并使用JPA进行多组学分析。根据综合的富集和网络拓扑指标，六种共享途径中的四种（细胞色素P450的异物和药物，谷胱甘肽，omega-6亚油酸代谢）位于“核心途径”的顶部（图4E）。重要的是，除上述途径外，FA延长和TCA循环还与类固醇激素的生物合成（通过细胞色素P450），牛磺酸-亚牛磺酸和半胱氨酸蛋氨酸的代谢（通过谷胱甘肽；见图3D）和脂质代谢（通过α-亚麻酸和花生四烯酸，甘油磷脂）图4F）与关。与细胞色素P450相关的异种生物和药物代谢表现出较高的中心度值，而中间度值较低。相反，谷胱甘肽，TCA循环，α-亚油酸和FA伸长率显示出较高的两种拓扑指标值，这意味着与构成中心但孤立的网络的异质药物代谢不同，其他途径同时具有中心性和高流量特性，表明它们连接了各种网络（图4F）。 为了调查饮食在每种喂养模式之外的特定影响和共享途径之外的影响，我们基于转录组或代谢物作为多组学JPA的输入；基于不考虑饮食之间定量FC的富集和拓扑指标，实际上被认为与饮食无关（图4B）。WIS / NIA比值中的FC> 1.2表示WIS饮食上调（图4A，红色条形），<0.8表示NIA饮食介导的上调（图4A，蓝色条形）。以下标准用于识别相关途径（图5，绿色框）：y轴，富集显着性（p <0.05 [log（p）>1.3]）和x轴，网络拓扑对途径的影响（> 0.5）。在MF模式下，两种饮食都占据了许多重要的途径，而NIA饮食会诱导肝脏的变化，WIS饮食则看不到这种变化。NIA饮食与各种途径相关，如“细胞色素P450介导的异种生物和药物代谢”，“ PUFA亚油酸”和“ NAD自救”，而WIS饮食主要促进了中枢分解代谢的途径，即碳水化合物，氨基酸和TCA循环（图5）。这些数据表明，在饮食的共享和特定途径中，两种饮食在实现健康和长寿的方式上可能存在细微差别。重要的是，查看图4B中描绘的CR响应途径，除了针对NIA的特定途径和共享途径之外，还招募了一些其他因素，但针对WIS则不然（图5）。再次，该分析指出了每种饮食所导致的针对特定因素（SCFA（例如，丙酸和丁酸）和PUFA（即亚油酸））的代谢和共享途径的细微差异。 总之，这些结果支持这样一种观点，即三种饮食方案与饮食组成无关，在与排毒，抗氧化剂，能量和信号传导途径相关的关键过程之间具有高度的拓扑连接性和功能互补性，具有高度的拓扑连接性，包括会影响免疫力和炎症的代谢产物。 5 与寿命调节相关的肝脏因子对饮食和喂养方式是否有反应 上面显示的代谢的大规模重新编程表明，与能量存储和利用有关的营养敏感因素可能与每种饮食和喂养方案的代谢过程同步有关。 我们评估了主要参与者，例如AMPK，SIRT1和NAMPT（烟酰胺磷酸核糖基转移酶），并发现NIA和WIS饮食对这些因素引起了不同的反应。对于NIA饮食，AL-MF-CR的治疗序列导致禁食期逐渐延长，显示SIRT1和NAMPT蛋白水平降低，但AMPK升高（图6A和6B）。对于WIS饮食，观察到了不同的模式，其中SIRT1和NAMPT虽然数值较高，但无显着差异，而AMPK从AL到MF到CR逐渐降低。AMPK响应于长期禁食而被激活，并且AMPK和SIRT1参与营养物感测、相互调节以及前馈循环NAMPT中的昼夜节律和代谢调节的串扰。 接下来，我们研究了与饮食无关的所有方案中这些关键调节剂之间的关系。 在SIRT1和AMPKa之间检测到非常紧密的逆相关性，这表明AMPK蛋白水平的增加可以补偿SIRT1积累的减少，反之亦然（图6B和6C）。重要的是，AMPKa表达与SIRT1特异性相关，但与SIRT6不相关（图6C）。NAMPT的丰度也与SIRT1相关，但与SIRT6或AMPK不相关（图6A-6C）。无论饮食类型如何，CR中的AMP含量均显着升高（图6D）。总之，这些结果表明AMPK，SIRT1和NAMPT是相互交织的，并且处于通过Gly-Ser-Thr代谢枢纽调节而进行的养分传感与生物代谢昼夜调节之间的交汇。 基于乙酰化的机制可能是对喂养方案反应的主要特征。有趣的是，已经有报道描述涉及了NAMPT和SIRT1的昼夜节律反馈回路，其中SIRT1被募集到Nampt启动子以通过抑制CLOCK-BMAL1转录活性来刺激其辅因子NAD +的昼夜节律合成。对于三种喂养方案中的每种喂养方案，使用抗乙酰赖氨酸抗体，在NIA和WIS饮食的小鼠肝脏裂解物中研究了蛋白质乙酰化作用对翻译后修饰的影响。尽管在NIA和WIS饮食之间的反应并不相同，但在CR标本中检测到了几种未鉴定的蛋白质，其水平发生了变化。这些数据与SIRT1 / NAMPT轴对CR特异反应的观点是一致的，尽管该反应的性质可能会因饮食成分而改变。 6 两餐之间的禁食时间引起小鼠和非灵长类动物在肝脏中发生类似的代谢重塑 我们先前在非灵长类动物（NHP）中的工作是当前研究的主要动机，该研究旨在找出决定CR对寿命积极影响的决定因素，并检查禁食或饮食组成在这方面是否很重要。先前报道的测试小鼠NIA和WIS饮食的研究表明，与饮食无关，空腹期的长度随寿命的延长而变化。在最初的NHP CR研究中，这两种地点的喂养方式是一个起点，WIS-NHP每天饲喂一次，其余食物则在一天结束时移走，而NIA-NHP每天饲喂两次，没有晚上清除食物。为了在NHP研究中探讨饮食的影响以及NIA和WIS之间的喂养方式差异，对禁食NHP雄性血清的非靶向代谢组学进行了研究。WIS动物年龄为18.0±0.2岁（对照组，n = 21；CR，n = 21），而来自NIA的动物年龄为18.0±3.0岁（对照组，n = 19；CR，n = 26）。在血清中鉴定出173种代谢物，其中PLS-DA显示AL和CR组之间分离良好，尤其是在NIA队列中（图7A）。一种相似的方法被用于分析来自我们当前研究的小鼠血清，揭示了155种代谢物，PLS-DA显示在AL，MF和CR之间表现出良好的分离效果（图7B）。来自对照和CR猴子的血清代谢物的热图显示了代谢物丰度的模式，这些模式显示了喂养方案和饮食组成的明显影响。使用两种不同的方法对这些数据进行了分析：首先，通过投影变量（VIP）分析了通过PLS-DA从WIS和NIA中分离出WIS和NIA的对照组和CR组的主要代谢物，产生了评分，该评分对每个代谢物的重要性进行了排名（图7C，上图）。接下来，随着CR的变化，代谢物丰度增加和减少的相关模式（图7C，下图）显示，脂质和酮体（紫色箭头），氨基酸（绿色箭头）和尿素循环中间体的循环生物标志物富集结果与禁食期间肝脏会利用脂质和氨基酸作为底物相关一致。有趣的是，尽管新陈代谢模式的总体变化模式相似，但饮食之间的排名并不相同，这表明，这两项研究的反应要素中有一些特定于饮食组成和食物摄入策略的差异。 接下来，对小鼠研究的代谢产物进行并排比较，确定了肝脏中53种代谢物和血清中37种代谢物的集合是AL-MF-CR组分离的主要贡献者。目测检查热图显示，肝脏中的氨基酸对饮食具有潜在的作用，但血清中却没有，饮食的变化似乎是由进食方式而非饮食驱动的，而在CR小鼠的血清中明显较低。饮食组成对血清戊糖磷酸途径的中间核糖和糖原降解途径的麦芽糖/麦芽三糖的影响是值得注意的。与WIS相比，在NIA饮食中MF和CR中的脂质和酮体（3-羟基丁酸酯）含量更高。与WIS相比，NIA中尿素循环的总体血清代谢产物，例如富马酸盐，瓜氨酸和N-乙酰谷氨酸含量较低。最后，与AL相比，两种饮食中CR和MF的氧化应激生物标记蛋氨酸亚砜均降低。接下来，我们从血清和肝脏数据集中进行了代谢物的单独分析，这些数据将丰度与每种饲喂方案赋予的寿命延长程度相关：AL <MF <CR。明确的模式出现了，其中氨基酸成分（绿色箭头）被确定为肝脏和血清饮食中与寿命相关的因素。肝Gly-Ser-Thr代谢均与寿命呈正相关（图7D，上图），而大多数循环氨基酸与寿命呈负相关（图7D，下图）。总体而言，这些数据表明，CR引起以氨基酸和脂质燃料源的利用为中心的空腹样代谢反应。 最后，我们检查了AL或CR下NHP和小鼠血清中代谢物的共性，并且与饮食组成无关。AL下雄性NHP和小鼠的血清代谢组共有49种代谢产物中的33种。相反，在34种血清代谢产物中，有7种是对CR的应答，并且属于与禁食相关的代谢途径，包括氨基酸和脂质代谢，氨循环，尿素循环，FA b氧化和PUFAs（图7E和7F）。因此，CR引起的代谢重塑在小鼠和猴子之间是相似的，表明在这些相当遥远的物种之间对CR的潜在代谢反应是保守的。 结论 空腹和卡路里，而不是饮食组成本身，是决定生存率的决定因素。在该文中，作者采用多组学和综合途径的分析方法，探索在两种饮食和不同喂养策略下与小鼠寿命和健康相关的代谢纽枢；结果表明禁食时间与CR和饮食摄入有关，它们对延长寿命有明显的作用；甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢是与寿命相关的关键代谢枢纽；短链脂肪酸和必需的PUFA代谢在健康寿命中扮演独特的作用；非人灵长类动物血清代谢组学数据重现了小鼠的一些关键代谢特征。 评论 总的来说，这项研究发现，每天一顿和热量限制这两种断食方式虽然有一些小的不同，但总体上都是通过激活丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸代谢轴，增强解毒作用，维持分子的合成周转、修复/维持以及减少氧化应激、保持肝功能的机制来达到延长寿命的效果。它不仅为我们提供了两种断食方式，还揭示了其中机制，未来说不定会成为新的预防或逆转衰老的药物靶点。 原文网址：https:///10.1016/j.cmet.2020.04.018 |
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