做过western的朋友经常会说,出不出条带是一门“玄学”,步骤都对,为什么出不来想要的结果? 看着别人的条带是这样的 而自己跑的条带是这样的 这样的
以及这样的
羡慕别人的同时,有没有想跑出好看的条带呢,这里小编总结了western条带会出现的常见现象,原因以及相应的解决办法。
现象 | 原因 | 解决办法 | | 一抗二抗宿主不同 | 确定一抗是来自兔还是鼠,使用对应二抗 | 组织中目的蛋白含量低 | 浓缩,放大信号 | 蛋白量不足 | 蛋白量在30-40ug中间,使用蛋白酶抑制剂设置阳性对照 | 转膜不成功 | 减少电流,延长时间,多加5-10%甲醇溶液,活化PVDF膜 | 抗体浓度不合适 | 设置浓度梯度,根据结果选择合适的浓度,调整孵育时间 | 洗膜时间过长 | 经验值5次,每次5min,根据实际情况有所改变 | 一抗不识别待检物种蛋白 | 对比免疫原序列和蛋白序列,确定抗体能与目的蛋白发生反应 | 封闭时间过长目标蛋白不显色 | 减少封闭时间 | 叠氮钠对二抗产生抑制 | 叠氮钠不要和HRP标记抗体一起使用 | 条带背景过高 | 膜干燥 | 保证膜和充分的反应液接触 | 封闭时间不够 | 延长封闭时间 | 抗体浓度过高 | 稀释抗体并延长孵育时间 | 孵育温度过高 | 4°C孵育 | 未结合蛋白没有洗干净 | 增加洗膜次数 | 出现杂带 | 蛋白降解 | 加入蛋白酶抑制剂 | 一抗浓度过高 | 降低一抗浓度 | 二抗浓度过高产生非特异结合 | 降低二抗浓度 | 蛋白样本具有多种修饰形式(乙酰化,糖基化,磷酸化等) | 去修饰后验证 | 出现目的蛋白多聚体 | 增加样品煮沸时间使蛋白充分解聚 | 细胞传代多导致蛋白表达不同 | 未传代细胞做对照 | 不是纯化抗体 | 使用亲和纯化的抗体 | 背景有斑点 | 抗体结合封闭液导致黑色斑点 | 更换封闭液 | 转膜时候有气泡出现白色斑点 | 转膜时用滚轴将气泡赶出 | 抗体在膜上分布不均匀出现白色斑点 | 使用滚轴孵育,保持摇动 | 白条带或者条带有空斑 | 抗体浓度过高 | 降低抗体浓度 | 条带“凹”形 | 电泳温度高改变迁移速率和pH | 4°C低温电泳 | 胶冷却不均匀 | 配胶时注意均匀 | 条带“凸”形 | 凝胶和玻璃挡板底部有气泡 | 配胶注意除气泡 | 拖尾 | 蛋白了太大 | 调整蛋白量 | 一抗浓度和时间太长 | 减少一抗浓度和时间 | 含有较多非蛋白大分子杂质 | 更换样品 | 非均一性背景 | 膜干燥 | 保证膜和充分的反应液接触 |
Western实验步骤比较繁琐,细节决定成败,在实验过程中还要根据实际情况随时调整,最后,小编在这里祝大家实验顺利,多出条带。 END 微科享,享科学 微科享是微生太旗下专注于学术知识免费分享平台,内容主要包括学术资讯、学术直播以及干货分享。 微科享仅用于学术成果分享与交流,不涉及商业利益。严禁他人将本公众号的内容用于商业运营。
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