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编译：魏冬，编辑：Emma、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 肺动脉高压是一种治疗方法有限的疾病，其中慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）因被证明可被肺动脉内膜切除术（PEA）治愈而成为例外。本项工作研究了CTEPH患者的血浆代谢组和评估有效治疗的可逆性并分析代谢紊乱的来源。 我们对CTEPH患者进行了非靶向的血浆代谢组分析，将健康对照和疾病对照组进行比较，并评估了响应PEA的代谢谱变化情况。对部分患者在三个解剖部位进行采样，并计算血浆代谢物梯度。 我们明确并验证了CTEPH患者血浆代谢物的变化情况。通过ROC分析确定了12种代谢物从而区分CTEPH和健康对照组（AUCs 0.64-0.94，所有p <2x10-5）和疾病对照组（AUCs 0.58-0.77，所有p <0.05）。许多代谢变化与特发性肺动脉高压（IPAH）中观察到的变化明显相似。仅有五种代谢产物（5-甲基硫代腺苷，N1-甲基腺苷，N1-甲基肌苷，7-甲基鸟嘌呤，N甲酰甲硫氨酸）可区分CTEPH与慢性血栓栓塞性疾病或IPAH。在部分而非全部代谢物中，可观察到对PEA的显着校正（15-100%的扰动）。解剖采样中鉴定出188种血浆代谢物，其中色氨酸，鞘磷脂，蛋氨酸和三羧酸循环代谢物具有明显的梯度。与CTEPH和梯度相关的代谢物也表现出与疾病严重程度的临床指标显着的相关性。 尽管观察到大多数的代谢变化在CTEPH和IPAH患者中很普遍，但我们仍确定了一种特定的代谢谱将CTEPH与健康对照和疾病对照组区分开。血浆代谢物的梯度暗示与PH和代谢物相关的心肺组织新陈代谢可能是评估未来靶向性治疗干预合适的非侵入性标志物。 论文ID 实验设计 实验结果 肺动脉高压（PH）被定义为静止状态下平均肺动脉压力的持续升高，并与右心衰竭和过早死亡的风险增加密切相关。PH的药物治疗进展仅局限于肺动脉高压（PAH）和慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）。这与新的疾病机制发现无关，而与负责血管舒张的靶向已知途径的改善以及与早期联合和扩大治疗的策略有关。通过使血液动力学正常化的肺动脉内膜切除术，CTEPH仍然是唯一可治愈的PH，这为研究病理生物学和对治疗的反应提供了宝贵的机会。 代谢组学允许疾病表现和定义表型潜力的高维分子映射。我们和其他研究者已经报道了特发性和遗传性肺动脉高压（IPAH / HPAH）患者的血浆代谢组学特征。在本文中我们将CTEPH患者与其他疾病患者和健康对照组以及IPAH / HPAH患者的血浆代谢组学特征进行比较，并试图确定是否通过肺动脉内膜切除术可纠正其代谢变化。我们还使用上腔静脉（SVC），肺动脉（PA）和桡骨动脉（ART）之间的血浆代谢组梯度来研究扰动的起源组织。 1. 实验参与对象 表1列出了基线特征。患有PH的患者表现出血液动力学变化和运动能力受损，主要对照组的概况见图1，详细情况见表1。 图1 主要的研究流程图和分析鉴定出的代谢物重叠 分析的对象包括慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者，健康对照组（HC），疾病比较组（DC-转诊发现无PH或患有慢性血栓栓塞性疾病（CTED）但无PH）以及特发性或遗传性肺动脉高血压患者（IPAH / HPAH）。无法手术的CTEPH患者或肺内膜切除术（PEA）之前取样的患者用于主要分析。PEA后对43例患者进行了采样，而另外82例患者仅在PEA后才同意进行采样。维恩图描述了分析CTEPH与健康对照组、CTEPH患者在PEA手术前后的代谢物重叠，以及与PH相关的组织血管床的血浆梯度，特别是肺动脉到桡骨动脉（PA-ART a）和上腔静脉肺动脉（SVC-PA b）梯度。上标标出了在针对IPAH患者的CTEPH分析中不同的代谢物。 表1 主要群体特征 2. CTEPH患者血浆代谢物谱的变化 我们首先比较了来自PEA术前或无法动手术的CTEPH患者和健康对照组的两组样本中血浆代谢物的水平（图1）。在Bonferroni校正后的发现和复制分析中，血浆中55种代谢物的水平可将CTEPH患者与健康对照组区分开（对照的平均差异为-0.33~-1.53 SD和+0.84~2 SD，p <1.54×10-4）。在校正了年龄、性别、种族、体重指数、肌酐、胆红素和药物治疗等潜在干扰因子后，其中35种代谢物可将CTEPH患者与健康对照组区分开来（p <0.05）。年龄影响17种代谢物，但CTEPH的平均影响大约比年龄高50-100倍，性别影响了11/35的代谢产物，而CTEPH的影响是性别的1.5-3.2倍。 校正潜在干扰因子后， 35种差异性代谢物中有19种可将CTEPH患者与疾病比较组区分开（p <0.05，图2）；10种代谢物含量升高，包括修饰的核苷（例如N2，N2-二甲基鸟苷）、单羟基脂肪酸和多胺和甲硫氨酸代谢的代谢产物，9种代谢物含量降低，包括磷脂酰胆碱、草酸、γ-谷氨酰-ε-赖氨酸和几种鞘磷脂。12种代谢物在CTEPH和CTED患者之间也存在显着差异（p <0.05），后一组作为无肺动脉高压和抗凝治疗的潜在慢性血栓栓塞的对照组（表2）。ROC分析确认了这12种代谢物，以区分CTEPH和健康人（AUCs 0.64-0.94，所有p <2×10-5）和疾病对照（AUCs 0.58-0.77，所有p <0.05，图3）。最佳临界值的敏感性和特异性分别达到57-92％和35-94％。最后，5种代谢产物与IPAH患者的PH比较组的CTEPH明显不同，其中最显着的区别在于5-甲基硫代腺苷（MTA，图2和图4A，表2）。 图2 35种可区分CTEPH患者与独立于混杂因素的健康对照和疾病比较组的代谢物热图 A.区分CTEPH与所有其他组的代谢物；B.区分CTEPH与健康对照（HC），疾病对照（DC）和慢性血栓栓塞性疾病（CTED）；C.区分CTEPH与独立于混杂因素的HC和DC，D.区分CTEPH 与独立于混杂因素的HC。 图3 区分CTEPH与健康和疾病对照组的关键代谢物ROC分析 ROC曲线证明了代谢物区分CTEPH与健康对照(左侧图)和疾病对照(右侧图)的能力。 表2 区分慢性血栓栓塞性肺动脉高压与健康和疾病对照组的代谢物 3. CTEPH患者与PEA手术相关的代谢物变化 我们假设某些代谢物的血浆水平与肺血管阻力（PVR）升高和伴右心室应变直接相关，则PEA将有望纠正CTEPH患者的一些代谢物水平。 37种代谢产物可区分PEA前后的CTEPH患者。在配对样品验证分析中（与健康对照组相比校正了15-100%的扰动），12种代谢物在PEA手术后也显示出显著变化，其中7种满足多种测试校正，包括N2，N2-二甲基鸟苷和鞘磷脂（图4B）。牛磺酸在未配对的样品中增加而在配对的样品中减少，表明这可能是假阳性；其他6种代谢物显示出一致的变化方向。 图4 关键代谢物血浆水平的箱形图和点状图 A.健康对照（HC），无PH的慢性血栓栓塞性疾病（CTED），疾病对照（DC），特发性肺动脉高压（IPAH）和慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）患者中的5-甲基硫代腺苷（MTA）。校正混杂因素后，CTEPH中的水平与HC、DC、CTED及 IPAH相比有显著差异。B. 与健康对照相比，43例CTEPH患者手术前后的血浆样本中鞘磷脂水平的箱形图。 4. 心肺代谢机制 我们假设心脏和肺部的代谢活动会影响血浆代谢组，有助于在CTEPH和先前的IPAH中观测代谢信号。我们分析来自IPAH和CTEPH患者的三个解剖动脉和静脉部位样本的代谢物梯度来测试这一点：上腔静脉（SVC），肺动脉（PA）和桡骨动脉（ART）（图5）。我们发现188个代谢物具有明显的梯度，梯度的重叠如图5所示。网络分析表明功能相关的代谢物簇与组织梯度密切相关。我们鉴定的代谢物中有21种在CTEPH中也具有明显的梯度（表3），包括α-酮戊二酸（TCA循环）和修饰后的蛋氨酸代谢物的SVC-PA和PA-ART梯度，单羟基脂肪酸（2-羟基棕榈酸酯）的PA-ART梯度和N-甲酰基甲硫氨酸及7-甲基鸟嘌呤的SVC-PA梯度（表3）。 与CTEPH和梯度相关的代谢物也表现出与疾病严重程度临床指标显著的相关性，且在代谢物与SVC-PA梯度（例如N-甲酰基甲硫氨酸，N-乙酰甲硫氨酸和α-酮戊二酸）和不良临床结果的测量（mRAP、心输出量和6MWD，影响大小估计高达+/- 0.432）之间观察到的关联性最强。 我们对4种或更多代谢物所代表的代谢途径进行了富集分析。TCA循环代谢物在SVC-PA和PA-ART梯度中均富集，而烟酰胺、烟酸酯、磷脂和溶酶体原代谢物则在PA-ART和ART-SVC梯度中得到富集；缩醛磷脂仅在PA-ART梯度分析中富集。 图5 具有显著的PA-ART，SVC-PA和ART-SVC梯度的代谢物重叠图 箱线图显示了来自SVC-PA（绿色）和PA-ART（蓝色）特定结果的代谢物等数据以及显著横跨三个梯度的α-酮戊二酸。SVC，上腔静脉，PA，肺动脉，ART，桡骨动脉。 表3 主要群体特征 缩略词：FC-倍数变化；SVC-上腔静脉；PA-肺动脉；ART-桡骨动脉；FDR-错误发现率（校正的p值） 5.与对手术反应的CTEPH相关的代谢物、和采样位点之间的血浆梯度的重叠 与对照及其对PEA手术的反应相比，我们检测了与CTEPH密切相关的一些代谢物并探索了代谢物水平与血液在不同血管床之间通过的关系。在图5中发现有11种代谢物重叠现象，特别是鞘磷脂和N2，N2-二甲基鸟苷与CTEPH相关并且在手术后发生变化，提示其与疾病发展和逆转密切的联系。 讨论 这种全面的血浆代谢谱已经鉴定出与CTEPH相关的循环代谢物以及响应有效治疗而变化的一些代谢物。代谢轮廓与临床严重程度相关表明了整个肺部和心脏的血浆代谢物水平发生变化，从而提供了生物学合理性。因此代谢谱分析作为评估PH治疗反应的非侵入性方法可能具有临床实用性。 CTEPH中观察到的大多数代谢变化与IPAH中观察到的显著类似，其中包括修饰的核苷含量增加，TCA循环中间体、单羟基脂肪酸、色氨酸、多胺和精氨酸代谢产物减少，鞘磷脂、磷酸胆碱和类固醇代谢产物减少。IPAH和CTEPH之间的代谢物水平差异较小，只有5种代谢物差异显著：5-甲基硫代腺苷（MTA），N1-甲基腺苷，N1-甲基肌苷，7-甲基鸟嘌呤和N-甲酰基甲硫氨酸。一些代谢产物（7-甲基鸟嘌呤，N-甲硫基蛋氨酸）也表现出从上腔静脉到肺动脉的血浆梯度，其中包括从冠状窦排出的代谢产物，表明其与心脏代谢的潜在相关性并进一步得到与血液动力学的显著相关性的支持。RNA修饰与多种疾病有关，包括各种类型的癌症以及对神经发育疾病的免疫。核苷修饰的动态和可逆性质将这些代谢物鉴定为监测治疗反应的候选化合物，例如PEA后N2，N2-二甲基鸟苷的变化就是例证。尽管许多代谢物受年龄和性别的影响，但我们发现与CTEPH相关的差异性更大并且不受这些和其他潜在混杂因素的影响。 PAH和CTEPH之间代谢紊乱的重叠是可以理解的并可能反映了心肺结构和功能的共同变化。CTEPH和PAH的肺动脉重塑和内皮细胞功能障碍以及随后的右心室重塑之间的相似性已得到文献充分证明，这意味着未来的治疗策略不仅可以在CTEPH中研究通过纠正观察到的代谢功能障碍，还可以在所有表现出相似代谢障碍的PH形式中进行。在研究CTEPH时很难分离开PH和慢性血栓栓塞的影响，因为这二者都可能影响新陈代谢。为缓解这种情况，我们将与没有PH的慢性血栓栓塞患者和IPAH患者进行了比较。尽管CTEPH患者的血栓栓塞严重程度和持续时间可能会保留一些影响，但我们观察到的变化很可能是由PH的血液动力学以及相关的肺血管重构和右心功能障碍所驱动。 我们探究了CTEPH患者PEA手术前后样本的代谢物变化并验证6种代谢物的校正，这些代谢物描述了术前和PEA至完全恢复后患者的相关代谢途径。其中的两种鞘磷脂通过结构和信号传导作用（包括细胞胆固醇和质膜稳态）在心血管健康中发挥重要作用，并且与血液动力学参数呈现显著的负相关。还原型α-生育酚是一种有效的抗氧化剂和细胞保护剂和可抑制血小板聚集并促进血管舒张并在衰竭的右心室减少，也在术后进行了矫正。PEA后3-尿嘧啶丙酸酯（一种能抑制呼吸复合物链的复合体V）的嘧啶分解产物也降至正常水平。修饰的核苷N2，N2-二甲基鸟苷可反映血管细胞的压力或过度增殖，已通过手术部分纠正从而增加了其在PAH中已确立的危险标志物的效用。这些标记物对CTEPH患者成功治疗下的反应是鼓舞人心的，因为它们可用于监测其他形式的PH的成功治疗。 在不同解剖部位对PH患者进行采样旨在表征跨组织（尤其是心脏和肺）的血浆代谢组的变化。在PA动脉梯度中还观察到了烟酰胺/烟酸酯（1-甲基烟酰胺具有抗血栓活性）、磷脂、溶酶体原和缩醛磷脂（抗氧化剂作为低氧诱导的磷脂酶靶点）代谢物的富集，至少部分反映了肺的代谢活性。在PA动脉和SVC-PA样本的梯度中发现了PH患者的TCA循环代谢产物的丰富度（如α-酮戊二酸）也升高。既往的代谢组学和影像学研究已证明IPAH和CTEPH中的生物能被破坏。TCA循环中间体的积累与线粒体葡萄糖氧化的减少相一致，这在PAH和治疗靶标中已有报道。肺动脉细胞、右心室和周围器官的线粒体功能障碍指向多器官能量的重新编程且被视为是PAH病理生理学的重要组成部分，我们的数据表明这也可能是CTEPH的重要特征。 在运动过程中，健康人群提高了血浆甘油（脂解），脂肪酸（泛酸）进入TCA循环的水平并扩大了TCA循环中间体系。在患有氧化磷酸化功能障碍（线粒体/麦卡德尔病）的患者中这些对骨骼肌需求增加的反应无法维持，同样TCA中间体和嘌呤代谢产物的破坏与PH中的RV-PV功能障碍和RV脂肪酸代谢紊乱有关。我们发现这些和其他途径中的代谢产物（修饰的核苷和溶血磷脂）与CTEPH患者的疾病严重程度和运动表现有关，可能需要进一步研究例如骨骼肌活体组织切片代谢组才能充分了解这些变化的组织特异性。对环境干预（饮食，锻炼计划）的反应可为人们对生活方式改变对疾病轨迹的影响提供新的思路。 虽然在心力衰竭方面已被证实，但越来越多的证据表明全身代谢的紊乱与PAH和CTEPH的发病机理有关，这似乎包括PAH中肠道微生物组的作用以及PAH患者粪便样本中富集的一些细菌类群和相关的微生物代谢物变化。根据这些发现，我们在本文中展示了微生物代谢物的扰动和显著的系统梯度，包括涉及色氨酸、鞘磷脂和磷脂酰胆碱的代谢。 这项研究的优势包括大样本量、严格的采样和处理条件、疾病对照、全面的临床评估（包括接近肺血液动力学的正常化）及其用于评估多种血浆代谢物的非靶向方法，但也有局限性：血浆样本是在CTEPH的晚期采集的，这使得很难将因果关系与补偿性变化区分开，且目前还未评估当前药物治疗对代谢谱的影响。在未来的研究中，直接在冠状窦中取样可以更好地表征跨心脏代谢机制，慢性疾病（如CTEPH）中血浆白蛋白水平降低更能代表炎症因此在评估营养状况方面的作用有限。为了获得最佳的临床效用需要通过收集准确的营养数据来了解昼夜变化和饮食对特定代谢谱的影响，但可从禁食状态下采样的CTEPH患者试验数据中获得一定的信心，这些患者表现出几种类似的紊乱。 结论 我们确定了可将CTEPH患者与健康和疾病对照组中区分开的代谢谱，但PAH和CTEPH之间的代谢紊乱重叠可能反映了心肺结构和功能的常见变化，且血浆代谢物梯度表征了PH相关的代谢物的心肺组织代谢。对手术有反应并改善的肺血液动力学代谢物可能是评估未来肺动脉高压靶向治疗的合适非侵入性标志物。 |
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