|
编译：王军，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 衰老过程通常伴随着癌症、骨质疏松、代谢紊乱、心血管疾病和神经退行性疾病等慢性病的发展和生理功能损伤，但衰老的高度多变性和多样性使研究者很难客观、准确地描述其特征。尽管世界卫生组织（WHO）提出了内在能力（IC）的概念，从个体幸福感、环境以及风险因素来综合理解衰老。但目前对于IC，依然尚无客观的定量与定性指标。本文从不同的分子水平，包括表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和微生物组学，综述了临床研究中所描述的最相关和最有潜力的生物标志物。希望帮助老年病学家、老年病医学专家和生物医学研究人员通过IC了解衰老进程。 论文ID 实验设计 1. 前言衰老是一个随时间变化的生理过程，其主要特征包括：线粒体功能紊乱、免疫力下降、有害蛋白或损伤蛋白的积累，以及自噬和表观遗传学的改变、体细胞和线粒体DNA突变的积累、异常的胞内通讯、端粒缩短和营养感知的改变等，上述这些改变会损害细胞和组织的功能，并导致衰老相关疾病的发生，从而导致个体部分生理功能的丧失，甚至导致机体死亡。 世界卫生组织（WHO）在2015年引入了内在能力IC的概念，这一概念涉及到了五个方面。这五个方面的因素会影响人的一生，或使个体健康长寿，或者加速个体衰老。而研究者通过IC这个新颖的概念捕捉到的多维观点也证明了个体所处的社会经济、医疗水平、生理和心理等方方面面之间的相互作用，能够显著影响个体的衰老方式。有意思的是，IC既有可能会随着年龄的增长而减弱，又会受到与健康和疾病相关的生活方式的影响而动态变化，也就是说IC这种减弱可以被某些因素逆转。 因此IC反应的是个体幸福感和环境之间的多维相互作用，它评估的是个体承受不利因素的能力，而不是脆弱指数（frailty index）。这种评估方法改变了以疾病为中心的范式，代之以保健功能中心范式，更有利于医护人员帮助个体实现健康长寿。然而，对IC概念的充分评估尚缺乏可靠的工具，这使得专业人员常常难以把握，因此，如果能借助一系列基于组学的，并且影响和贯穿个体一生的生物标志物（Biomarker），IC的整体观点就可以很容易地迁移到临床上，去评估个体的健康状况，并用于开发干预措施，以实现后代的健康长寿。 而与衰老相关的生物标志物则可作为定量或定性地描述个体健康状态的替代方案；再者，衰老领域的转化研究和临床研究应考虑纳入已被公认的衰老生物标志物，以便将IC概念中所涉及到的研究领域和潜在机制联系起来，因此，从表观基因组、转录组、胞外RNA（包括microRNA、长链非编码RNA等），以及端粒长度、蛋白质组、代谢组和微生物组等多个组学水平进行研究，可以为我们提供更完整、全面的图景；并且，像这样，从整体上理解生物各个系统之间相互作用的“系统生物学”也是一个新的生物学分支，这样可能有助于我们获得一个全新的视角，来研究各个层面以及暴露组与个体内在生物学之间的整个相互作用。 另一方面，众所周知，同一物种的不同个体的衰老速度不尽相同，即使在同一个体的不同组织和器官中，这种衰老速度也有很大差异，这表明衰老可能具有组织特异性；然而，这些特定组织的相关变化经常影响器官功能，导致其他系统的损伤，例如，心血管系统的结构性衰老可能会导致神经退行性改变、认知障碍和肾脏疾病，此外，与代谢综合征相关的功能变化可能会影响肌肉和免疫系统的衰老，并对认知功能产生重大影响。 衰老和长寿的研究可以通过能够反应器官、系统和表型、临床表现之间的精确关系的生物标志物来表征；同时，生物标志物可以解释引入新概念的串联失调，如我们上面讨论的IC。IC的降低是由于整个生物系统中相互关联的生理网络之间失去了复杂的相互作用，也与衰老表型的发展有关；然而，为了直接支持这一假说，还需要更广泛的数据来研究多个生物标志物在个体情况恶化前的长时间内的纵向表现。 结合系统生物学研究和转化研究的结果，研究者发现了从不同衰老阶段的组织样本中获得的不同生物分子的特征，这些生物分子能够预测个体的发病率、死亡率和机能健康状况，这些分子就是所谓的“衰老生物标志物”。目前，一些关于老年科学的研究都集中在识别这些衰老的生物标志物上，本文综述了当前临床研究中生物标志物与衰老相关表型之间关系的主要研究，因此，区分时序年龄和生物年龄至关重要。 时序年龄即个体从出生到死亡所经过的时间，但如果要准确评估生物体的生理功能、健康状态或衰老程度，时序年龄有其局限性；而生物年龄，或称生理年龄，是指一个个体在其时序年龄的特定时间的一般健康状况，反映了个体的内稳态能力和IC。由于生物年龄已被用作评估死亡率和疾病风险的指标，相当于将多个生物标志物合并为一个指标，这有利于我们解释复杂的衰老过程，因此，生物标志物也可以整合IC与时间之间的关系。在后面的章节中，我们将描述不同的多组学临床研究，包括表观遗传学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和微生物组，以便为老年病学家和老年病医生在临床实践和研究中，选择使用最有潜力的生物标志物提供参考。 2. 表征衰老表观遗传学的方法表观遗传学的改变是指在不改变基因型或者DNA序列的情况下表型的改变，比如DNA的甲基化、乙酰化、组蛋白修饰以及非编码RNA（ncRNA）和基因组的3D结构的变化，环境是造成这些变化的主要原因，有意思的是这些变化具有高度遗传性。 DNA甲基化（DNAm）是一种复制后修饰，通常出现在胞嘧啶的CpG岛（CpGislands），从而引发基因表达的变化，外界环境和一些疾病都能够对甲基化产生影响。在针对人体的研究中，DNAm的研究方法已经相当标准化，也获得了长足的发展，是目前研究最多的表观遗传学，研究表明外周血的甲基化发生频率和死亡率相关。 此外，353位CpG的DNAm能够有效评估生理年龄，因此也被其发现者Horvath命名为表观遗传时钟（DNAmAge）。DNAmAge是一个可靠的检测工具，因为它与死亡风险相关，可作为预测衰老相关疾病，包括癌症和Ⅱ型糖尿病的预测因子。Horvath的表观遗传计算器可以独立于组织样本的来源来确定表观遗传年龄，并且代表了第一代基于DNA甲基化的衰老生物标志物，被广泛用于多项临床研究；还有一个类似的指标，被称为Hannum时钟（Hannum’ clock），这是一种基于血液73位CpG 甲基化的表观遗传年龄的标志物，反映了关于免疫衰老和免疫系统状态的信息。 基于DNAm的生物标志物已被开发并用于评估寿命和死亡风险，例如，Zhang Yan等人在一项为期14年的随访研究中发现了分布于19条染色体的58个CpG位点，这些CpG与全因死亡率有关。这其中有10个CpG被用作心血管疾病和癌症死亡率的强有力的预测因子，并且提供了一个基于表观遗传学的一般死亡率风险评分；类似地，Levine等人提出了一种称为表观年龄(PhenoAge)的寿命预测因子，它反映了一些与时序年龄相关的变化，该预测方式不仅基于CpG，还考虑了生活方式的变化和临床上的表型观测，将表观遗传学与寿命（lifespan）以及健康寿命（healthspan）的变化联系起来。此外，Ake T. Lu等人还开发了一种新的工具，名为DNAmGrimAge，它包括与年龄相关的各种条件、临床生物标志物、生活方式因素、以及腹部和内脏脂肪断层扫描相关的DNAm变化，该工具与寿命、共病总数和糖尿病风险高度相关，并且，机体总的DNAmGrimAge变化显示出对死亡率、冠心病、癌症和糖尿病的预测能力。 2.1 表观遗传时钟及其与年龄相关表型和疾病的关系表观遗传时钟与时序年龄、性别、认知能力受损、握力降低、肺功能减退以及某些特定血细胞类型有关。此外由于DNAmAgeAccel（译者注：The discrepancy between DNAmAge and chronological age isreferred to as biological/methylation age acceleration）的增加与损伤的积累显著相关，后者通常被用来描述衰弱程度，因此Horvath时钟也与脆弱指数（一种与年龄相关的脆弱状态，用以衡量多个系统的损伤程度）相关。 Horvath和Ritz的另一项研究报道表观遗传时钟的首次加速与帕金森有关，在这项研究中，作者还表示这种加速也会对免疫系统产生影响，因为在帕金森PD患者体内，DNAmAge与粒细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞）的数量高度相关。这项研究也支持了外周炎症进程在衰老过程中加速了外周血细胞甲基化的假设，应进一步研究以建立帕金森病患者的早期诊断生物标志物。 正如上文所述，表观遗传衰老的指标也与慢性退行性疾病有关。从这个意义上说，帕金森病患者的Horvath时钟与淀粉样蛋白负荷、神经炎斑、弥漫性斑块、神经原纤维缠结和整体缠结评分显著相关，主要原因是，淀粉样蛋白负荷和神经炎斑是影响帕金森病患者DNAm和认知障碍的主要因素；他们的分析还表明表观遗传年龄、神经病理学指标和认知衰退之间存在相关性。 同样，对于癌症，如乳腺癌、肾癌、肺癌、皮肤癌、前列腺癌、卵巢癌和甲状腺癌患者的肿瘤组织，Horvath时钟和Hannum时钟都表现出更高的表观遗传年龄，研究显示DNAmAge的增加可以预测肺癌患者的死亡率。对于骨关节炎（一种与衰老相关的软骨退行性疾病），受软骨组织的影响，Horvath时钟显示表观遗传年龄增加。表观遗传时钟测量还具有评估临床干预效果的潜力，例如，锻炼能够影响与肌肉减少症相关的基因的DNAm，相应的表观遗传学时钟的测量值也较低；此外，Horvath表观遗传时钟和生活方式之间关系的研究表明，表观遗传加速度随着肥胖和代谢综合征的增加而增加（BMI值增加） 目前尚不完全清楚表观遗传时钟代表了生理或细胞衰老的哪些方面。来自胚胎和诱导多能干细胞的数据显示，表观遗传时钟在这个发育阶段接近于零；同样，百岁老人也表现出比对照组更低的表观遗传年龄。这一证据表明表观遗传变化与个体的发展过程有关，因为大多数百岁老人都设法避免了与年龄相关的疾病的发生。最近在原代内皮细胞中的研究——Horvath时钟测量结果显示，衰老细胞表现出表观遗传年龄的增加，这与DNA损伤诱导的细胞衰老形成对比，表明表观遗传衰老是细胞的固有特性；另一方面，绝经后的个体也表现出较低的DNAmAge，这表明激素因素似乎会加速表观遗传衰老。虽然现在提出表观遗传时钟作为衰老的精准生物标志物还为时过早，但基因组技术（包括MeDIP-seq和微阵列）的一些进展将有助于更好地理解衰老过程中DNAm的含义及其与衰老的生理相关性，这也可能反过来，很快转化为公共卫生和临床实践中的具体应用。 尽管利用表观遗传时钟来预测生理年龄已被广泛接受，但需要强调的是，在将其转化为临床实践之前，需要仔细考虑这些分子方法（的准确性），例如，DNAm是高度动态的，因此，需要纵向研究来了解表观遗传时钟在个体的生命轨迹中是如何变化的；另一方面，众所周知，衰老过程表现出组织特异性，但表观遗传时钟包含整体组织老化的变化，这就降低了其描述生物年龄的稳定性；此外，目前的表观遗传时钟是用少量样本归纳获得的，过少的样本会导致时序年龄和生理年龄之间的预差产生偏差，因此，表观遗传时钟还应该用来自不同人群、种族、性别、组织、细胞和疾病的大规模数据来归纳总结。表观遗传学研究的另一个限制是技术层面；表观遗传学时钟最常用的方法是甲基化450 K芯片（Beadchips, Ilumina Human Methylation 450 K）。依诺米那公司最近开发的Infinium MethylationEPIC Array（升级版的甲基化芯片，覆盖面更广），能够将CpG数量增加到850 K。从这个意义上说，且不论花费和分析成本的增加，甲基化检测本身就面临重复性和假阳性的问题。 3. 转录组作为衰老的生物标志物的研究虽然有部分研究描述了不同组织中的转录组与衰老的关系，但本文重点论述外周血液样本中的研究，这些研究展示了可重复、有潜力的衰老生物标志物。在最初的研究中，Kochunov等人的研究中报道了一组差异表达显著的基因，研究者在其中的8个基因中，捕捉到了71 %与健康老龄化相关的转录变异，这8个基因分别是：GFBP3、LRRN3、CRIP2、SDC、IDS、TCF4、GATA3和HN1，有趣的是，这些基因还能调节细胞增殖、粘附、分化和炎症，并与某些临床指标如人类灰质厚度相关；并且，这些研究结果还都和性别有关，这表明性别在改变衰老进程中扮演了重要的角色。这也意味着在进一步研究生物标志物对衰老进程的作用时，需要考虑性差异，例如，一项在90岁以上个体的单核细胞中进行的研究显示，女性比男性更容易受到促炎通路的影响，这表明性别特异性免疫发育受到雌激素和睾酮水平的影响，或者受到以前如女性中更普遍的巨细胞病毒感染的影响。 由于衰老过程具有直接的组织/细胞特异性，因此，区分血液样本中分离到的细胞群体至关重要。一项有关多个族群的动脉粥样硬化研究中，研究者通过转录组学方法分析了外周血中分离得到的CD14+单核细胞和CD4+ T-细胞，结果表明，衰老在不同的细胞群体中诱导不同的途径。例如，在CD14+ T-细胞中，约有388个差异表达基因与线粒体途径或细胞生物合成过程的调控相关；而在CD4+ T-细胞中约有188个与免疫反应相关的差异表达基因；而负责蛋白质合成的核糖核苷酸复合物在两种细胞群中都发生了下调。这些研究表明，衰老会影响多条细胞通路，例如染色质重塑基因的表达和DNA甲基化，这可以用随年龄增长而发生的转录组的变化来解释。 通过大规模的转录组分析，可获得研究健康老龄化的有用生物标志物组，结果也表明与年龄相关的基因表达可作为衰老生物标志物的潜在来源。先前的研究已经鉴定到了五种可以精确区分< 65岁和≥75岁个体的基因的转录（LRRN3, GRAP, CCR6, VAMP5, and CD27，译者注），该组基因（LRRN3、CD27、GRAP、CCR6、VAMP5和CD248）的表达与IL-6、肌肉力量、血尿素和血清白蛋白等临床指标相关。有趣的是，“生物学上更年轻”的个体往往表现出较低的IL-6（一种炎症标志物）水平和血尿素水平，以及较高的血清白蛋白水平，后者会随着年龄的增长而降低。总之，这些结果显示，“生物学上更年轻的个体”肾脏功能更好，残疾风险更低，也表明转录组研究在老年个体分类研究中具有积极作用。 一项针对来自不同年龄段的14983份外周血样本的转录组研究，得到了1497个与年龄相关的基因，其中涉及到DNA甲基化、RNA代谢、线粒体通路和DNA修复的上调，而固有免疫、适应性免疫和肌动蛋白重塑表现出下调。此外，研究者基于1497个转录本的表达水平计算出了一个衡量转录年龄的线性模型，并将它们与实际年龄进行了比较，结果显示转录组年龄和时序年龄之间的相关性在0.348到0.744之间，平均差异在4.84到11.21岁之间。这些结果还表明，生物/转录组衰老可能与较高的收缩压和舒张压、高密度脂蛋白、胆固醇、空腹血糖水平、胆固醇和体重指数直接相关。此外，BMI校正后的吸烟者的上述相关数据表现出更高的转录年龄，这些结论可以给IC提供参考。 但有意思的是，转录时钟和表观遗传时钟之间的相关性很低(ρ = 0.10−0.33)，这表明不同的方法描述的是衰老生物学的不同方面。但关键还是要控制技术变量和相关的调查设计，以确定这些结果之间的差异是否确实是因为技术缺陷引起的。由于转录年龄预测因子在独立的族群中的研究有限，导致其在临床实践中的应用受到限制，因此还需要对其在不同族群中的重复性及其对衰老表型的影响进行更广泛的验证研究。 4. 胞外RNA与衰老过程4.1 miRNA作为衰老的生物标志物 MicroRNAs（miRNAs）是一类新的非编码小RNA，由21-25个核苷酸组成，参与大量生物学过程的调节，其中就包括新陈代谢和衰老。miRNAs的表达模式与许多与年龄相关的疾病有关，包括心血管疾病、癌症、糖尿病、高血压和肥胖症等。在长寿和老年人的单核细胞和血清中进行的几项研究显示，miRNAs与年龄有关；然而，大多数这些研究都是在小样本量上进行的，导致对miRNA的表达变化和年龄这两者之间进行统计学研究受到限制。 miRNA的表达一直存在争议，例如，一项为识别miR-eQTL而进行的全基因组关联研究（GWAS）证明miRNA受到基因的控制；此外，作者使用时间和时序年龄之间miRNA表达水平的线性模型建立了一个名为miRNAΔage的miRNA年龄指标，结果表明，miRNA年龄的增加与冠心病、高血压、血压和血糖水平有关。根据作者的说法，由于miRNA的表达发生了变化，因此相应的靶标可作为评估衰老加速和年龄相关疾病的潜在生物标志物。 也有报道称，在骨骼肌减少症（一种与年龄相关的骨骼肌质量和功能丧失）中，出现了一组miRNAs的表达失调，其中miR-181a、miR-434-3p、miR-431、miR-29和miR-126最为突出。有趣的是，这些生物标志物参与衰老肌肉细胞的凋亡、老化和IGF-1信号传递。与表观遗传时钟和转录年龄相比，miRNAage表现出较低的相关性，相关系数分别为0.3和0.2，表明两种度量标准的分子机制有所不同；另一方面，在精神分裂症和抑郁症患者脑部的尸检结果中的研究显示，miRNA的表达取决于遗传因素及其所在位置对基因转录途径的影响，因此在计算miRNAage时，可以将这些因素考虑在内，以便获得更精确的结果。 在弗雷明翰心脏研究所（FHS）进行的一项5000名受试者参与的研究中，研究者检测了血液样本中ex-RNAs(miRNAs、piRNAs和snoRNAs)与中风之间关系，这也是相关研究中样本量最大，也最可信的社区性研究。这项研究确定了以miRNAs为靶点，并且与炎症、凝血和血小板激活相关的基因通路；此外，本研究表明miR-19a-3p可作为缺血性卒中的生物标志物。同样，这项研究表明，如果将miRNAs分析作为辅助工具，便可帮助临床医生预防和改善患者的预后，使中风风险较高的个体受益。由于在老年群体中观测到了较高的中风风险，而中风的发生与衰老相关，因此，可以考虑将miRNA作为鉴定衰老相关的生物标志物。 研究发现，在致癌基因诱导的衰老中，miR31HG的表达上调，这是多梳基团介导INK4A位点的抑制所必需的；另外，miR-34a的表达与人类听力损失相关，还有一项针对老年人血浆的研究表明miR-21是一个潜在的炎症生物标志物。而其他miRNA在老年人中的表达减少，如与炎症过程相关的miR-151a-3p、miR-181a-5p和miR-1248。miR455-3p等miRNAs已被建议作为AD的早期生物标志物；有趣的是，miR-455-3p靶向淀粉样前体蛋白基因的3’UTR，表明它在AD的致病过程中发挥作用。虽然miRNAs在细胞内的作用以及与细胞的关联仍处于研究之中，但已有多项研究表明它的确参与衰老相关的疾病。 目前miRNAs已被应用于治疗心脏代谢和神经系统疾病，并是公认的数种疾病的生物标志物，这表明miRNAs与衰老过程以及与衰老相关疾病之间有内在联系。进一步的纵向研究应该着重探究来自不同组织的miRNAs之间的关联，以便将它们整合到一个多组学手段中。 4.2 LncRNAs作为衰老的生物标志物 另一组新的生物标志物是长非编码RNA(LncRNAs)，它是另一类非编码RNA，长度超过200个核苷酸，并且没有开放阅读框架，在生物体基因组中，lncRNAs的分布和表达高度相关。最近，细胞衰老中的lncRNA研究为我们提供了不同的见解，例如，在增殖中的细胞中下调lncRNAMALAT1（转移相关肺腺癌转录本1）会导致细胞生长减少；并且，通过激活p53，降低MYBL2的表达，会导致细胞衰老。类似的，在衰老过程中，LncRNAX非活性特异性转录本（Xist）的表达水平的下降和女性一条X染色体的印迹和沉默有关。 神经元相关lncRNAs的表达也影响神经元的表观遗传学变化和细胞核3D结构的维持。此外，被称为Terra（端粒重复序列RNA）和TERC（端粒酶RNA组分）的端粒-lncRNAs在衰老过程中调节端粒酶活性和神经干细胞的存活。LcnRNAs还可能通过促进蛋白质聚集和神经退行性疾病参与神经元疾病的发生，这意味着与年龄相关的LncRNA表达障碍可能影响神经发生和突触可塑性等神经元过程。此外，衰老的人脐静脉内皮细胞中的研究结果显示转录本Meg3与心血管衰老有关。 要将LcnRNAs作为生物标志物，还需对其功能进行进充分认识。而对其进行进一步地转化研究，才能使其特征更好的描述衰老进程中的动态变化。 4.3 circRNA作为衰老的生物标志物 环状RNA（CircRNAs）通常是由编码蛋白质的外显子反向剪接产生的RNA转录本。有趣的是，就像在衰老的大脑中一样，这些转录本会在衰老过程中积累，表明它们可能是潜在的生物标志物。又由于可以在人类唾液、血清和全血中检测到CircRNA，因此对这些分子的鉴定作为人类衰老生物标志物可能非常有用。而在血液样本中，环状RNA与线状RNA的比率高于其他组织，这表明在临床研究中，血液中的CircRNA是一类易于检测的外周生物标志物。 但目前尚缺乏对AD和PD患者细胞或组织中广泛分布的CircRNA的研究。最近一项对RNA-seq数据库的分析表明，几种CircRNA在多系统萎缩症（MSA，一种平均发病年龄在50-60岁之间的散发性神经退行性疾病）中上调，因此，我们有必要研究老化神经元和胶质细胞的剪接变化，这可能为研究衰老过程中这些剪接变化提供线索。但需要注意的是，目前还不清楚大脑中CircRNA这种积累是有益的还是有害的，当然，与miRNAs相比，细胞中CircRNAs的总体丰度较低，说明这种积累不会影响老化的神经元。 4.4 PIWI-piRNAs作为衰老的生物标志物 PIWI-piRNA通路与维持基因组完整性有关，是衰老的一个重要标志。生殖细胞、胚胎干细胞和成体干细胞对PIWI-piRNA的表达也有明显的偏好。最近的一项研究表明，果蝇肠道干细胞（ISC）中的PIWI基因的敲除会削弱其再生能力，促进凋亡。先前的研究表明，PIWI的表达足以减少与衰老相关的反转录转座子的表达，减少DNA损伤，减少ISC的缺失变异和凋亡。这一证据将PIWI-piRNA定位为衰老过程的一个有趣的研究靶点；目前相关机制尚缺少在人体中的研究，但其依然可能是一种潜在的衰老生物标志物。 5. 端粒的长度作为衰老的生物标志端粒是位于真核生物染色体末端的蛋白保护帽，由重复的DNA序列组成（TTAGGG），其长度是典型的衰老生物标志物。随着细胞的分裂和个体的衰老，端粒会不断缩短，端粒的大幅缩短会导致染色体稳定性减弱、染色体衰老和DNA损伤。一项大样本（n=105539）人群调查结果显示女性的端粒长于男性，这表明生物的衰老存在性别差异，端粒的缩短和寿命之间的关联也得到了广泛的研究。在临床研究中，心血管风险因素，例如吸烟、营养不良、肥胖、久坐、高血压等都和白细胞具有较短的端粒长度有关。端粒长度短是心血管疾病的一个危险因素，动脉粥样硬化斑块中的端粒过短，会导致斑块不稳定，增加中风和急性心肌梗死的风险。 一项大规模观察研究和meta-分析也表明，端粒长度和衰老相关疾病有关；另一项研究报告心力衰竭患者的白细胞端粒长度减少了近40 %。尽管对于阿尔兹海默症（AD）和帕金森综合征病人的白细胞端粒长度还存在争议，但研究表明AD患者的端粒通常较短。最近的一项针对八种主要研究的meta分析结果显示端粒长度和帕金森综合征之间并无关联，相比之下，其他疾病如糖尿病、高血压、肥胖等慢性病都与端粒长度存在高度关联。 需要说明的是端粒的测量容易出现偏差，例如，不同群体使用的不同方法进行定量PCR，这也可能导致结果不一致。但总的来说，流行病学证据表明，端粒长度，特别是白细胞的端粒长度，可能是不同病理和衰老过程的有用生物标志物，然而，这一假设仍有待于纵向研究的检验。 6. 衰老的蛋白质组学生物标志物蛋白质组学研究作为一种将基因型和表型联系起来的方法，有助于快速确定细胞、组织或生物体中的总蛋白质含量；此外，蛋白质组是高度动态的，并且随时间变化，这表明识别随年龄显著变化的主要蛋白质的蛋白质组谱可能有助于医学决策的制定和治疗干预。Semba等人的一项研究显示多肽和蛋白质的循环可能与衰老的加速有关，这些多肽包括GDF8前体肽及其成熟蛋白以及GDF11前体肽及其成熟蛋白，它们都参与炎症过程，这些结果涉及与促炎细胞因子相关的疾病过程，包括心血管疾病和阿尔茨海默病。一项在人类股外侧肌蛋白质组学分析中的研究也证明老年人中参与有氧代谢的蛋白质水平增加，并且相关代谢也发生了变化。 蛋白质组学有望破译衰老进程中不同生理状态下通路所处的状态，尽管如此，迄今为止很少有关于人类衰老的蛋白质组学研究。此外，研究还表明，翻译后水平的变化与衰老有关，例如人血清和血浆中蛋白质-蛋白质糖基化的改变，一项结合四个欧洲族群的，关于免疫球蛋白糖基化在衰老中的作用的研究结果表明三种IgG糖基化模式(FA2B、FA2G2和FA2BG2)随年龄变化很大，与端粒长度相比，这可能是一种更准确的计算生物年龄的方法。 新生儿、儿童和成人血浆的对比研究表明，随着我们年龄的增长，与铁运输、稳态、免疫反应和细胞凋亡相关的蛋白质含量显著增加。另一项在汉族人群血浆中进行的研究表明，载脂蛋白A-1(APOA1)水平在18-50岁之间上升，同时纤维蛋白原α水平下降，这表明这些蛋白可以作为衰老的生物标志物。为了理解与人类健康和衰老相关的分子机制之间的差异，Menni等人计算了11种蛋白质在老年人中的差异表达；这些结果具有高度的重复性，可能是一个有用的生物标志物。脑脊液蛋白是研究蛋白质随年龄变化的极佳对象，例如，一项对90名21岁至85岁的认知健康成年人进行的研究显示，与年轻人相比，老年人脑脊液中参与炎症的蛋白质含量更高。 蛋白质组学是一项有用的技术，可以用于开发复杂衰老过程中的生物标志物，也可以建立一个与时序年龄准确相关的蛋白质组图谱，例如，百岁老人代表了健康老龄化，因为他们中的大多数人都逃脱了与年龄相关的疾病。Santos-Lozano等人重点介绍了与正常衰老（CLEC3B，CRISP3，IGFALS，TAS1R3和TGFBI）和异常衰老（AOPEP，CD14，CDKL1和CRTAC1）相关的十大蛋白质，并对百岁老人（100-103岁，n=9）和作为对照(67-81岁，n=9)的步行能力受损（异常衰老）老人的血浆蛋白质组进行了比较分析。这项研究的数据与增强的健康免疫功能、较低的促炎状态、保存的体液免疫反应、与ATP酶活性相关的蛋白质含量、微管运动活性、血管生成和细胞内连接相关，根据这些数据，作者建议将这些蛋白质作为实现健康老龄化的临床干预措施的目标候选或生物标志物。 此外，Johnson 等研究者对36个蛋白质组研究(3301个个体，年龄18-76岁)进行了系统的综述，发现两个或多个蛋白质组研究共有的32种蛋白质，涉及不同的途径，如炎症、凝血级联、细胞外基质结构组织和基因调控。其中有23个蛋白质(VEGFA、PTN、FGA、GDF15、IGFBP6、HGF、MMP12、TNFRSF1等)表达增强，可作为蛋白质组衰老时钟的指标。当这一蛋白质组学时钟被应用于在不同的族群（等距尺度，n=3301，18-76岁）中预测患者年龄时，结果显示与实际年龄的皮尔逊相关系数为0.71。这项研究具有很高的相关性，它精确地描述了与衰老相关的蛋白质，以及随着时间的推移，相关基因的表达轨迹。 Sebastiani等人进行的另一项有趣的研究分析了来自百岁老人和他们的后代，以及无关对照的244份血清样本的蛋白质组图谱。结果表明，有1312个蛋白质组间差异显著，有趣的是，其中的484个蛋白质也在其他独立的蛋白质组学研究中高度表达。作者发现百岁老人拥有与年轻人群相似的表达模式，此外，来自网络分析的数据显示，在不同群体中有相似的蛋白质模块，这表明这些模块的组成在不同群体之间是相似的，只是丰度不同。作者得出结论，基因表达调控的变化与长寿和极端长寿高度相关。 SASP图谱是一个全面的蛋白质组学数据库，包含了与衰老相关的可溶性蛋白和外泌体运输因子，是理解衰老驱动因素的一个有趣的创举。在此背景下，Basisty等人在一项蛋白质组学研究中证明，细胞衰老和个体衰老生物标志物在蛋白质含量上重叠。在这些蛋白质中，GDF15、SCT1和丝氨酸蛋白酶抑制剂尤为突出，它们可能是有效的生物标志物。尤其是GDF15——一种参与免疫反应和免疫衰老的有丝分裂因子，它在老年人体内含量增加，且不受性别或种族的影响，也可能是一个潜在的衰老生物标志物，值得进一步研究。 正如本节描述的那样，尽管目前在该领域进行了一些尝试，但仍缺少可以提供全面、可靠和可重复的蛋白质组生物标志物的研究。这类研究的主要局限包括技术可及性、对大范围蛋白的检测极限、组织选择、蛋白质分离方案，并且缺乏对不同人群的研究，以避免由于性别差异或疾病的不同阶段而产生的差异和不可比较性信息。 7. 衰老的代谢组学生物标志物与衰老相关代谢物的改变可用于衰老进程的评估。代谢组学的研究表明，不同的小分子在正常生理状态和疾病状态下，会因为生化途径的改变而有不同程度的积累，因此代谢组可以表征衰老进程中代谢通路的改变。有关人成纤维细胞、外周血单核细胞和骨骼肌的一些研究确立了一些与衰老相关的潜在代谢组生物标志物，这些生物标志物包括与营养感知、蛋白质和脂类代谢缺陷有关的蛋白质。目前，鉴于代谢组与年龄有定量的相关性，且具有高度敏感性和特异性，代谢组学已被认为是一种很有潜力的生物标志物来源。 由于氧化磷酸化在衰老过程中受损，而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在线粒体电子传递中起重要作用，因此可作为生物标志物。一项在15-77岁的受试者进行的研究显示，与新生儿相比，NAD+的分解代谢随着年龄的增加而增加，也就是说NAD+水平随着年龄的增长而降低，这限制了能量的产生和DNA修复。Sirtuins蛋白（NAD+依赖的脱乙酰酶和ADP核糖基转移酶）在衰老过程中，特别是在肝细胞和骨骼肌中表达下调。这种下降与sirtuins功能障碍、线粒体功能紊乱以及调节营养供应的新陈代谢感应有关。目前大多数衰老研究都集中在研究sirtuin通路，特别是SIRT1、SIRT2和SIRT6，当三者的含量降低时，线粒体功能出现障碍，并导致老化线粒体的积累。并且随着年龄的增加，线粒体的生物发生也会减少。 参与衰老过程的其他营养传感器还有mTOR和AMPK通路。有趣的是，在线虫中，寿命的延长与mTOR的抑制有关；相应，在衰老的人类卵巢上皮中，mTOR的活性有所增加。AMPK感知营养压力和衰老，这种激酶在骨骼肌中含量的增加，可能是由衰老过程中线粒体损伤和代谢功能障碍产生的AMP的积累引起的；另一个研究比较充分的代谢途径是生长因子1（IGF-1）的减少，最近的研究表明，IGF-1水平较高的患者比最终发展为痴呆症的患者表现出更好的认知和功能表现。 糖基化终产物（AGEs）来源于蛋白质、脂质和核酸的糖基化，这些物质在衰老组织中积累，导致炎症和细胞凋亡。此外，AGEs还与衰老和神经退行性疾病，如AD中认知障碍的发展有关；例如，在年轻人和老年人中进行的一项研究表明，老年人的戊烷脒（一种AGEs，译者注）水平会增加；然而，AGEs在衰老过程中损害认知功能的机制仍不清楚。 在一项对337名50-73岁的老年人进行的研究中，摄入较高的AGEs会导致CD4/CD8比值下降，促炎和免疫生物标志物和C反应蛋白增加，这表明AGEs水平较高的个体遭受了氧化损伤，打破了机体抗氧化的动态平衡，导致免疫系统衰老。值得注意的是，CD4/CD8比值本身就是与老年人死亡率相关的免疫风险表型的一部分。这一领域还需要进一步的研究，以便于设计新的营养策略，在食品加工的过程中避免过高浓度的AGEs。 Chak等人分析了来自两个族群（KORA，317名女性和273名男性；CALA，195名女性和191名男性）的590份血清样本，分别持续了7年和4年的时间，发现了9种在女性和男性中差异表达的代谢物。女性的主要代谢物为鸟氨酸、精氨酸、丝氨酸、酪氨酸和C18，男性的主要代谢物为鸟氨酸、精氨酸、PCaaC36：3和PCaeC40：5。由于他们和凋亡、线粒体功能紊乱、炎症、自噬、抵抗氧化压力有关，因此作者认为，这些代谢物可能会导致衰老。 Deelen和Kettunen在2019年对来自12个族群，18-109岁的44168人（5512人在研究期间死亡）进行了研究，值得注意的是，代谢特征可能是临床试验和医疗决策中死亡率的间接预测因子。该研究发现了14种循环的生物标志物，其中包括极低密度脂蛋白、小高密度脂蛋白、多不饱和脂肪酸/总脂肪酸、葡萄糖、乳酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、乙酰乙酸、白蛋白和糖蛋白，这些都分别与全因死亡率相关。该模型对5年和10年死亡率的预测准确度优于其他模型，一旦代谢生物标志物在临床上得到验证，这些标志物就可被医生用与患者救治。 总体而言，因其可以在人群中进行研究，并且代表了包括基因组、表观遗传、转录组和蛋白质组在内的复杂分子网络的结果，反映的是整个系统的衰老表型，因此，代谢组生物标志物很有潜力；然而，这种方法最大的问题在于数据处理，因为代谢物是来源于不同的生物材料、体液、组织或细胞中的小分子，并且由于分离效率低、分析方法不同，常常导致代谢物的含量被低估。尽管有上述缺点，但可以通过跨学科、领域的研究使相关的研究标准化，以便将其应用于临床实践中；因此，衰老的下一步研究将是代谢组学分析，但还需要进行纵向研究，以便深入了解衰老和衰老相关的疾病所涉及的代谢和信号通路。 8. 人类微生物组和衰老人类微生物组由和人体具有共生关系的细菌、古生菌、真菌、原生动物、病毒等组成。微生物组在人体的各个部分，包括皮肤、眼睛、口腔、鼻腔、生殖系统以及消化道等都有分布，并且受环境影响（生活方式、压力、锻炼、饮食、药物作用以及宿主的年龄）。在不同的器官之间，微生物群落的丰度也有所不同。而且值得注意的是，在个体的一生中，微生物组是动态变化的。 微生物群落的丰度会随着年龄的增加而减少，特别是与新生儿、青少年和成年个体相比，老年人的微生物组丰度有明显下降。而与Ⅱ型糖尿病、结直肠癌、炎症性肠道疾病、肠息肉、肝硬化和老年衰弱相关的微生物数量会随着年龄的增长而显著增加；此外，微生物组的改变也称为生物失调，可能会对宿主的健康产生负面影响，因为许多微生物群体衍生的代谢物通过促炎细胞因子（IL-1B、IL-23、IL-17、IL-22和肿瘤坏死因子-α）影响免疫反应，导致全身炎症。微生物组还影响营养物质的吸收、消化能力和新陈代谢，并刺激抗炎细胞因子和细菌淀粉样蛋白的产生，从而对宿主健康产生负面影响，因此，生物医学和转化医学研究主要集中在了解微生物组如何影响衰老过程或与年龄相关的疾病也就不足为奇了。 有研究报道，老年人会表现出一种特殊的微生物组表型。其特征是具有抗炎和免疫调节作用的细菌数量减少，这可能是导致衰老过程中常见的疾病和紊乱的原因之一。参与这一过程的主要种类有拟杆菌属、另枝菌属、副杆菌属、粪杆菌属、反刍球菌属、梭状芽孢杆菌属和辅球菌等，若要将微生物组作为衰老的生物标志物，就需要将目前在衰老领域的研究中的微生物群落和其代谢物结合在一起，但这类研究目前还很少，比如，将人体微生物群落与人体血液样本中存在的代谢物联系起来——例如，一项对30名年龄在5岁到67岁之间的受试者进行的小型研究显示，随着年龄的增长，与色氨酸和吲哚代谢相关的细菌明显减少，而色氨酸的转运和代谢对T细胞的分化，以及认知功能至关重要，这一发现表明，富含色氨酸的饮食可能有助于缓解与衰老相关的不良健康影响。 类似的，微生物组及其代谢物可以作为区分健康和不健康老龄化的客观指标。与至少有一种合并症的人相比，没有合并症的老年人（健康老年人），肠道微生物组中阿克曼属菌的数量更丰富；有趣的是，这些能够降解结肠粘液的菌对消化系统有好处，因为它们在饮食干预肥胖的过程中起到了抗炎和改善新陈代谢的作用；同样，厚壁菌与对人类健康有害的影响有关，并且在不健康的老年人中数量增加。最后，与非健康老龄化相比，健康老龄化进程中大肠杆菌/志贺氏菌和链球菌的数量也有所减少。 微生物组似乎是一种很有前途的工具，可以用来描述个体的健康状况，并基于益生菌开发有针对性的治疗策略，以改善宿主的健康状况。评估微生物组的变化有助于衡量抗衰老治疗的效果以及对衰老相关疾病的临床干预，然而，在将它们确定为通用的衰老生物标志物之前，有一些问题亟待解决，比如进一步的微生物组研究应该包括其他微生物，如病毒、真菌和古生菌的影响，以及宿主的其他特征，如种族、营养和遗传因素，这些特征在影响微生物组的群落组成、功能以及免疫反应方面至关重要。此外，由于衰老本身是一个复杂和异质的过程，找到一个可重复的、适用于不同人群的微生物组学指标可以使样本收集系统化，也有利于从纵向研究中收集数据。解决这些问题将促使微生物组成为一种合理的衰老生物标志物，使其成为帮助我们更好地理解个体衰老与环境之间关系的工具。 9. 总结正如本文所述，有许多分子都可作为生物标志物来表征衰老进程——包括与年龄相关的疾病。其中的每一个标志物都可能是很有潜力的候选工具，这些基于组学的生物标志物最终可以整合成一个生物标志物组，帮助老年病医生和老年病学家进行诊断和预后干预，并对IC架构中包含的多维概念进行定量和定性的描述。本文主要基于公认的衰老特征，关注分子层面的衰老生物标志物；然而，我们需要将这些类别整合成更完整的，并且在临床上可以使用的方法，这也有助于实现IC指数的标准化。 表观遗传时钟是一种很有潜力的工具，可以用来衡量环境对衰老的影响，但还需进一步的研究，才能将其与临床结果和特定的疾病发展过程联系起来，也才能对疾病发展过程中所发生的变化进行更为精确的估计。表观遗传时钟分析表明，衰老进程与时序年龄没有本质联系，因此本文更强调研究生物年龄（包括生物年龄的加速）与衰老相关的疾病或健康老龄化之间的相关性；此外，在老年个体中很容易观测到特定的转录和转录后特征，因此整个基因组的转录图谱或可用于测量生物年龄（转录年龄）。鉴于小RNA和长链非编码RNA也比预期更多地参与到了衰老的进程中，并且被认为是一种有用的生物年龄（miRNA年龄）测量方法，因此需要在不同的体液和组织中进一步研究；另一方面，尽管人们对端粒进行了广泛的研究，但由于技术上的局限性，导致端粒的相关研究常常不可重复。蛋白质组似乎是研究衰老的下一代手段，因为这一领域的研究结果是组学技术中最容易重复和验证的；然而，蛋白质组技术的实际应用仍然存在一些缺陷，比如其成本过高，并且在临床应用中很难获得精确的结果，这些都限制了它的应用，而对于代谢生物标志物，其局限性则是现有的证据有限，且纵向研究太少。但是，通过系统化地收集数据，建立可重复的生物标志物组，不同研究之间由于微生物和种族不同而造成的结果误差便可被充分考虑在内，上述诸多局限性也将会有所改善（图 1）。 图1 通过基于组学的主要生物标志物来表征衰老表型 正如许多研究者所描述的那样，衰老是一个复杂且多样化的过程，需要通过客观的分析工具来理解它。基于组学的生物标记物的开发或是实现这一目标的理想途径。上图呈现的是与衰老表型的最相关的生物标记物。 在精准医疗的背景下，我们需要进一步的分析，才能逼近真相，比如系统生物学，它可以将不同复杂程度的结果与临床资料和临床效果进行关联和补充，此外，需要强调的是，本文所提到的研究大多集中在描述生命中单个时间点的衰老生物标志物，而并未评估这些生物标志物随着时间的变化，或者并未使用整体多组学基础来评估这些生物标志物是如何相互作用的，从这个意义上说，纵向研究是理解生活方式如何塑造衰老表型以及影响衰老过程发展的基础。目前，通过纵向研究，提出衰老生物标志物尚缺乏足够的文献；此外，上述组学技术在应用于临床前还有诸多限制和挑战，例如，组学方法和分析方法的多样性、样品的可获得性和重复性导致批次间存在差异，所以还需要进一步的方法学验证和质量控制分析。因此，未来的研究应该考虑建立相关标准，特别是配对的病例对照研究和临床试验、生物信息学以及统计分析。总体上，本文所综述的这些研究将有助于临床医生严格评估生物标志物，并在日常实操中青睐这类高通量技术。 正如Solovev等人提到的那样，多组学方法在生物标志物领域得到了越来越多的关注，因为这些技术提供了更加深入的视角，涵盖了衰老过程中复杂的代谢、遗传、表观遗传和信号通路等诸多特征，因此，我们建议将多组学生物标志物组和完整的个人幸福感评估结合起来，将有助于客观地描述IC这一新的多维概念，以确定哪些方面是影响个体走向异常衰老的主要驱动因素。此外，这种能够同时整合这些多组学的系统生物学方法，将帮助我们更好地理解IC及其对健康老龄化的影响，也将为我们提供对器官和系统特定功能（Ageotypes）的洞察力，帮助我们理解不同生理进程中的代谢、免疫和结构功能的相关特征，以及它们在个体生命周期中的变化。 图2 通过多组学生物标志物组从内在能力（IC）的多维角度理解衰老过程 IC，涵盖了生命力（代谢/能量平衡）、认知、感觉（听觉和视觉）、社会心理和运动，是一个动态的指标，取决于个体内在的稳健性；IC是多维的，可能受到（环境、营养、多病、体检和护理支持）的干预和其他因素（疾病和风险因素）的影响，导致健康或不健康的衰老。然而，IC的主要问题是缺乏标准化的衡量指标。由于多组学方法（基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和微生物组分析）是捕捉个体生理状态的高通量技术，我们建议将多组学生物标志物组和完整的个体幸福感评估相结合，将有助于客观地描述IC多维概念，以确定哪些方面是造成异常衰老的主要驱动因素。 综上所述，尽管目前仍然有太多需要进一步了解的地方，但将组学技术转移到临床治疗领域有助于更加全面地表征衰老的进程，帮助医生更好地理解健康老龄化（healthy aging）的含义，并将以疾病为中心的研究范式转变为以健康为中心的范式，以改善老年医学的临床决策。 |
|
|
