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编译：萌依依，编辑：Tracy、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 微塑料(MPs)可以吸附生物或环境基质中的有毒化学物质，从而影响其行为和可用性。我们将大肠杆菌(E.coli)在一个复杂的、明确的培养基中生长，并用聚苯乙烯微塑料(PS MPS)和二氯二苯三乙烷(DDT)处理人体相应浓度的MPs和DDT，以了解MPs和有毒有机物的复合污染对微生物生长和代谢的影响。我们利用一种新型固相微萃取(SPME)探针捕获的体内代谢产物，用来反映大肠杆菌在不同污染胁迫下的代谢失调情况。结果表明，DDT的毒性效应具有显著的剂量依赖性，PS的存在减弱了DDT对大肠杆菌的生长代谢干扰效应。吸附结果揭示了PS通过降低DDT在培养基中的游离浓度来减弱其不利影响的机制，大肠杆菌的三羧酸(TCA)循环相关酶活性和抗氧化防御相关物质也证实了这一机制。本研究有助于加深我们对MPs与有毒有机物对微生物的生态毒性的认识。 论文ID 实验设计 实验结果 1.污染物处理和细菌生长 我们首先通过细菌生长曲线研究了不同污染物处理(表2)对细菌生长的影响。如图1和表S1所示，大肠杆菌的生长随着DDT暴露水平的增加而下降。高浓度DDT(DDT-H)作用32h，对大肠杆菌的生长抑制率达45.2%(p<0.05)，而在人体相应的多糖硫酸酯(PS)暴露剂量下，暴露后细菌生长抑制率为8.3%(p<0.05)。在恒定浓度PS(1mgL-1)和不同浓度的DDT(10、200和1000 nM，表1)条件下，我们考察了聚苯乙烯塑料微粒(PS MPs)和DDT的联合抑制作用。如图1所示，中、高剂量的PS和DDT联合作用(DDT-MPS和DDT-HPS)与单纯DDT暴露相比，其联合生长抑制率明显降低。DDT-LPS组的生长抑制率与PS组相似，高于DDT-L组。根据大肠杆菌在不同污染胁迫下的生长曲线，PS的存在降低了中、高浓度DDT对大肠杆菌的生长抑制作用；同时，PS与低浓度DDT的联合抑制作用主要以PS为主，MPS可以减轻砷对土壤动物的毒性效应。我们之前的一项研究还表明，与环境相关的PS暴露水平可以有效降低多氯联苯对大型蚤的致死率。 图1 大肠杆菌在DDT、PS以及PS和DDT复合污染下的生长曲线 所有误差条代表从八个独立化验中确定的标准偏差。对照与处理间差异显著(P<0.05)。 与对照组相比，DDT-L组和DDTM组细菌未见明显的壁或膜损伤(图2)；同样，PS、DDT-LPS和DDT-MPS组的大肠杆菌也未表现出明显的结构变化。从透射电镜图像可以看出，PS MPs的大小约为1μm，短茎大肠杆菌的长度在1~3μm之间。 我们观察到一些PS颗粒与细菌细胞表面有直接接触，但没有一粒PS颗粒进入细菌细胞，而在暴露于最高剂量DDT的DDT-H组中，我们发现一些处理过的大肠杆菌细胞被破坏，而其他细菌仍然保持其完整的结构(图2)。我们在DDT-HPS组中也观察到了类似的结果，总体而言，人体相应浓度的PS和10~200 nm的DDT对细菌形态的影响很小，但高浓度的DDT会对细菌的细胞结构造成明显的破坏。 图2 暴露于DDT、PS以及PS和DDT复合污染下的大肠杆菌的透射电镜图像 2. PS -MPs对DDT的吸附 如图1所示，大肠杆菌的生长抑制率随着DDT暴露水平的增加而增加。我们通过曲线拟合发现，细菌生长抑制率与DDT浓度成正比，线性拟合系数大于0.998(图3，拟合方程1)。如上所述，PS的存在降低了中、高浓度DDT对大肠杆菌的生长抑制作用，而PS与低浓度DDT的联合抑制作用主要以PS为主。为了弄清这一现象的发生机制，我们对DDT/PS联合处理培养基中的游离DDT浓度进行了检测。在吸附平衡条件下，DDT-LPS、DDT-MPS和DDT-HPS培养基中的游离DDT浓度分别为1.2nM、31.6nM和341.0 nM。如图3(拟合公式2)所示，DDT-MPS和DDT-HPS组的线性曲线比DDT-L组、DDT-M组和DDT-H组的截距稍大，斜率略低。结果表明，PS和DDT在中、高浓度联合作用下的细菌生长抑制率也主要受培养基中游离DDT浓度的控制。 为了降低PS对DDT的毒性，我们可以提出三个假设：(1)PS与DDT构成竞争，从而减少了大肠杆菌对DDT的吸收；(2)PS通过结合和混凝的方式减少了水溶液中的DDT总量，然后成簇下降到瓶底，无法被大肠杆菌利用；(3)PS和DDT的结合降低了DDT的游离浓度。一般来说，大肠杆菌对DDT和PS的吸收是两种不同的方式，因为DDT是一个小的有机分子，而PS是一个微米级的颗粒。就毒性效应而言，它们不应该相互替代，因此假设(1)被否决；其次，根据TEM图像(图2)，我们在PS和DDT联合处理组中没有观察到PS颗粒的结合或凝聚，假设(2)不成立；第三，吸附结果表明PS降低了处理培养基中DDT的游离浓度(图3)，此外，通过曲线拟合发现，细菌生长抑制率与游离DDT浓度成正比。这一结果很好地支持了假设(3)，表明添加PS MPs可以降低DDT的自由溶解浓度，从而通过减少DDT与微生物细胞的直接相互作用而减小其毒性效应。 图3 大肠杆菌生长抑制率与培养基中游离DDT浓度的关系 黑色方块和拟合方程1代表了DDT暴露组大肠杆菌生长抑制率与DDT暴露浓度之间的关系。 3. 微生物体内代谢产物分析 为了评估微生物的代谢失调行为，我们采用非靶向性体内挥发性代谢组学图谱来表征模式菌在不同污染暴露下的反应代谢物。在本篇文章中，我们最近的工作提出了一种疏水-亲水平衡的SPME探针，它对非靶向代谢物具有高覆盖能力，被用来提取大肠杆菌的体内代谢物(图4A)。结果，我们用SPME/GC×GC-QTOF-MS方法鉴定出31种体内挥发性代谢物，主要包括烃类、吲哚类、醇类、酚类、酯类、酮类以及含氨基化合物(表S2)，而多变量无监督主成分分析(图4B)绘制了总的显著代谢物特征图，显示了大肠杆菌在不同污染暴露下的反应代谢特征的明显分离。总的来说，大肠杆菌产生的挥发性代谢产物与空白培养基产生的挥发性物质有很大的不同。 随着DDT暴露浓度的增加，处理菌与对照组之间的代谢差异更加明显。这一结果表明，细菌在DDT暴露下的代谢变化是剂量依赖性的，这与细菌生长曲线上的情况是一致的(图1)，在PS暴露下，大肠杆菌的代谢特征也与对照组有明显差异。此外，DDT和PS引起的反应代谢特性的分离趋势不同，与生长抑制结果相似，DDT和PS对大肠杆菌的联合代谢干扰作用表现出一个有趣的趋势，即PS的存在降低了DDT的代谢干扰作用。 使用监督分析，用各污染物处理组和未处理对照组的检测代谢物数据建立的OPLS-DA模型显示出良好的模型预测能力(图4和S1)。在OPLS-DA计分图中，各治疗组和对照组之间的反应性代谢特征也分别得到了很好的区分。 图4 (A)对照组和PS组中检测到的代谢物的SPME采样方案和GC×GC-QTOF-MS总离子流色谱图；(B)空白微生物培养基(BK)、未经处理的大肠杆菌(对照)和暴露在不同污染压力下的大肠杆菌体内挥发性代谢物的PCA计分图。 我们利用聚类热图(图5)进一步可视化体内代谢物的相对含量，该热图用色标表示行Z分数，以图形表示代谢物量的差异。总体而言，在不同污染压力下处理的模式菌在代谢物热图上显示了特征指纹，根据已鉴定代谢物的系统聚类法，DDT-HPS、DDT-MPS和DDT-LPS组与DDT-M组表现出更多的共同特征和更密切的亲缘关系。OPLS-DA分析获得的重要代谢标志物(VIP化合物)显示，DDT-M、DDT-HPS、DDT-MPS和DDT-LPS组共有5个共同代谢标志物。 此外，在体内微生物代谢物的采样过程中，我们在被DDT污染的微生物系统中发现了几种DDT的降解中间体，而在被污染的培养基中没有检测到，包括p，p'-DDD，p，p’-DDE和DDMU(图4和S2)。根据检测到的DDT污染微生物体系中的降解中间体，我们初步推导出DDT在大肠杆菌中的降解路径。 4. 细菌胞外氨基酸的图谱分析 为探讨DDT和PS对细菌氨基酸代谢的影响，我们分别在不同污染胁迫下对细菌培养12、24和32h后的胞外氨基酸进行了监测，其中包括8种必需氨基酸和12种非必需氨基酸。与体内挥发性代谢物的结果不同，所检测的氨基酸的PCA图谱在不同的污染暴露下没有显示出明显的响应代谢特征差异(图3和S4，表S3-S5)。结果表明，在设定的污染胁迫下，不同组别大肠杆菌胞外培养系统对氨基酸的吸收和释放没有明显的组间差异。 5. 三氯乙酸（TCA）循环相关的SDH和MDH活性 我们又对TCA循环中的重要酶SDH和MDH活性进行了研究。TCA循环是三种主要营养物质(蛋白质、脂肪和碳水化合物)共同的氧化途径，也是相关能量转移和物质代谢过程的枢纽。SDH和MDH在生物体内营养物质的完全氧化或相互转化中起重要作用，这两种酶的活性可以作为评价TCA循环运行程度的指标。 根据结果(图6)，与对照组相比，处理大肠杆菌组的SDH和MDH活性表现出相同的变化趋势。总体而言，低水平的DDT暴露似乎不影响酶的活性。随着DDT暴露浓度的增加，SDH和MDH活性明显降低，DDT-H组的酶活性抑制率分别达到59.7%和56.9%(p<0.05)。而PS处理组的SDH和MDH活性仅有轻度抑制，抑制率分别为10.3%和3.7%。在PS和DDT联合处理组中，SDH和MDH活性的变化相比单纯DDT处理组有所减轻，这与上述生长和代谢因素相一致。 图6 不同菌群的SDH、MDH、SOD活性和GSH含量 所有误差条代表从三个独立的化验中确定的标准偏差。 6. 抗氧化防御相关的谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶活性 在不利的外界压力(如电离、紫外线辐射或污染)、细胞内代谢紊乱和生物体的氧化应激下会发生，并产生大量的活性氧(ROS)和自由基。一旦活性氧和自由基的生成率超过机体抗氧化防御系统的清除能力，就会造成一系列的毒性效应。为了抵御逆境，微生物形成了相应的抗氧化防御机制，包括抗氧化酶系统和谷胱甘肽循环系统。 超氧化物歧化酶(SOD)是清除ROS的第一道防线，在大肠杆菌的抗氧化防御系统中起着至关重要的作用。与对照组相比，DDT处理组的SOD活性随暴露浓度的增加而显著升高，而PS处理组的SOD活性变化不明显(图6)。结果表明，大肠杆菌SOD对DDT暴露高度敏感，但对PS的人体相关暴露剂量不敏感。在PS和DDT联合处理组中，大肠杆菌的SOD活性在不同暴露水平均低于单独DDT处理组。这可能是因为在PS和DDT联合处理的培养基中，DDT被吸附在PS表面，游离DDT浓度明显降低。 除SOD外，大肠杆菌中降低的GSH会与抗氧化酶形成抗氧化应激，帮助生物体清除过量的自由基和ROS，从而减轻氧化应激造成的损害。如图6所示，DDT处理的微生物组的GSH含量也随着暴露浓度的增加而明显增加；然而，与SOD活性不同的是，PS处理组的GSH含量显著增加，是对照组的两倍多。以前的工作中也观察到类似的现象，即在PS颗粒下处理大型水蚤时，GSH和SOD值没有在同一水平上增加。结果表明，在不同暴露水平下，PS和DDT联合处理组的大肠杆菌GSH含量均高于单独DDT处理组。与SOD活性相反，大肠杆菌的GSH含量对DDT和PS都高度敏感，PS和DDT联合处理对GSH含量有协同作用。本文以谷胱甘肽和超氧化物歧化酶作为辅助证据，证明PS和DDT污染会影响微生物细胞的氧化应激状态，然而，需要一套完整和独立的研究来研究不同污染胁迫下微生物抗氧化应激的具体机制。 结论 毫无疑问，整个环境和人类都暴露在无处不在的MPs污染之下，并受到不容忽视的环境和健康风险；另一方面，微生物在人类健康中的作用不容忽视，大量报告显示，微生物对人类活动的方方面面都有贡献，如免疫反应、神经元活动和代谢平衡。因此，探讨MPs污染引起微生物生理代谢紊乱的机制具有重要意义。本研究通过对大肠杆菌的代谢组学和细菌学研究，探讨PS、MPs和DDT对微生物生长、代谢和代表性氧化应激因子的联合作用。结果表明，DDT的不良影响表现出明显的剂量依赖性，PS的存在降低了DDT对大肠杆菌的生长抑制作用和代谢干扰作用。吸附结果揭示了PS通过降低细菌培养中游离DDT的浓度来减弱DDT的不利影响的机理。 根据检测到的DDT污染微生物体系中的降解中间体，我们初步推测了DDT在大肠杆菌中的降解路径。与之前的大多数研究相比，这项工作中的污染暴露剂量与人类有关。相关讨论和结果对MPs污染的毒理学研究具有较高的参考价值。在未来的研究中，仍然需要更多的细菌种类和类型来更深入地了解微生物的理化特性与MPs及吸附在它们上面的污染物之间的关系。 此外，本文所研究的PS MPs的大小约为1μm，由于其相对较大，不能进入细菌细胞，因此，MPs可以通过降低DDT的游离浓度来降低其不良影响。其他文献已经证明纳米塑料对水生生物和陆地动物显示出更高的毒性，一旦纳米塑料进入细菌细胞，塑料和吸附在其上的危险化学品对微生物的联合毒性效应可能要复杂得多，因此，我们的进一步研究将继续集中在纳米塑料和危险化学品对更多肠道微生物的复杂联合毒性效应上。 |
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