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编译：不二，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读哺乳动物的大脑很复杂，拥有多种不同的细胞类型及不同的功能，但是每种细胞类型对衰老的影响仍然未知。研究者对年轻小鼠和老年小鼠的大脑进行了单细胞转录组分析。本研究提供了几乎所有大脑细胞类型中衰老相关基因、信号通路和配体-受体相互作用的综合数据集。分析确定了协调不同细胞类型的标记基因和调控特定细胞类型的基因，这些基因有时甚至以相反的方式表达调控。这些数据表明，衰老过程是在每种细胞群体中开启不同的基因转录过程，并且它们突出了大脑衰老过程中关键的分子过程，包括核糖体的生物发生。总之，这些大规模数据集（可在https://portals./single_cell/study/aging-mouse-brain上在线访问）为神经科学界提供了资源，这将促进对理解和改变衰老过程的更多发现。 原名：Single-cell transcriptomic profiling of the aging mouse brain通讯作者：Methodios Ximerakis & Lee L. Rubin通讯作者单位：美国哈佛大学干细胞与再生生物学研究所DOI号：10.1038/s41593-019-0491-3小鼠样本-解剖大脑组织-细胞分离-单细胞测序建库-高通量测序-数据分析（图1a）。为了获得关于影响衰老过程新的、更精确的见解，研究者使用高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）来鉴定年轻小鼠和老年小鼠大脑的转录谱（图1a）。由于组织的复杂性，哺乳动物成年大脑细胞的分离具有挑战性，因此作者首先开发了一种新的分离方法，该方法能够分离出年轻和老年大脑健康且完整的细胞。然后，作者分析了来自8只年轻（2-3月龄）和8只老年（21-23月龄）小鼠大脑的50212个单细胞（24401个年轻细胞和25811个老年细胞）的转录组。作者首先使用常规聚类算法来聚集转录相似的细胞。接下来，去除了可能由于细胞碎片或死细胞导致的低质量细胞簇，并进行质控。最终，分析鉴定了25种细胞类型的37069个细胞（图1b），不同细胞类型具有不同的表达谱（图1c，d），它们分为：少突胶质前体细胞（OPC）、少突胶质细胞（OLG）、嗅鞘神经胶质细胞（OEG）、神经干细胞（NSC）、星形胶质细胞限制性前体细胞（ARP）、星形胶质细胞（ASC）、神经元限制性前体细胞（NRP）、未成熟神经元细胞（ImmN）、成熟神经元细胞（mNEUR）、神经内分泌细胞（NendC）、上皮细胞（EPC）、睑板腺细胞（HypEPC）、脑室膜细胞（TNC）、脉络丛上皮细胞（CPC）、内皮细胞（EC）、周细胞（PC）、血管平滑肌细胞（VSMC）、表达血红蛋白的血管细胞（Hb-VC）、血管和软脑膜细胞（VLMC）、蛛网膜屏障细胞（ABC）、小胶质细胞（MG）、单核细胞（MNC）、巨噬细胞（MAC）、树突状细胞（DC）和中性粒细胞（NEUT）。图1e显示了每种细胞类型的细胞数和其他指标。为了揭示每个细胞群体的异质性，根据它们的表达谱、细胞谱系、功能和解剖组织使用了又一轮聚类，将这些细胞类型分为6类（少突胶质细胞谱系、星形胶质细胞谱系和干细胞、神经元谱系、室管膜细胞、脉管系统细胞和免疫细胞）。这些数据的子集使作者能够突出显示细胞类型中更多的细微变化。这个二次分析确定了很多不同的细胞亚型和身份，这些亚型和身份反映了不同的功能、成熟和位置的细胞特性。这些细胞身份与最近的scRNA-seq研究一致，其目的是鉴定新的不同的细胞类型或亚型，并创建发育中和成年小鼠大脑的详细图谱。这个过程使作者能够以高分辨率对来自年轻和老年大脑的所有经过实验验证的细胞群体生成全面的基因表达谱，它也使研究人员能够鉴定不同年龄和不同细胞类型的标记基因。作者发现在很大程度上细胞特性依旧保留在老年大脑中，其中所有细胞聚类都覆盖了两个年龄段的所有细胞。此外，从年轻细胞类型和老年细胞类型中产生的数据质量相似，每种类型拥有类似数量的独特分子标识（UMI）和检测到的基因。接下来，作者比较了所有转录基因的变异系数，观察到许多细胞类型在年轻细胞和老年细胞之间转录变异的差异。但是，变化的方向性在细胞类型之间并不相同，这表明衰老与转录变异升高没有广泛的联系。通过研究每种细胞类型的丰度，发现年轻和老年的大脑细胞组成在很大程度上是一致的（图2a）。尽管如此，作者认为OPC、NRP和ImmN数量的下降与衰老有关（图2a），这与已有的报道一致，并揭示了某些OPC、OLG、ASC、mNEUR和MG细胞亚型内潜在但无统计学意义的种群转移。值得注意的是，由于它们对组织解离的敏感性不同，尽管每种细胞类型比例不一定能反映它们在小鼠大脑中的实际比例，但是观察到的细胞类型比例的变化似乎反映了实际的生物学效应。通过在新老细胞类型与神经元亚型之间进行差异基因表达（DGE）分析，研究了小鼠大脑随着衰老而发生的转录变化幅度。在总共检测到的14699个基因中，3897个基因对至少一种细胞类型的衰老有显著影响[（FDR）<0.05]。当考虑表达变化的幅度时，有1113个基因超过了10％的变化（FC）阈值（图2b）。有趣的是，不考虑细胞类型的话，其中有1027个基因有显著变化（531个上调和496个下调），而在不同细胞群体中有86个基因的表达变化相反。鉴定随衰老而显著变化的基因以及FC的计算取决于几个因素，包括每个细胞种群中的细胞数、转录水平和分析算法。为了确保这些衰老标记基因的有效性，首先从总体的角度出发，将数据与已报道对小鼠衰老大脑的转录组数据进行比较。研究者汇总了所有已测序的细胞，创建了传统的全脑转录图谱。如预期的一致，该分析验证了已报道确定的衰老相关基因（例如B2m、C4b、Ctss、Il33和Rp18）。此外，本研究中使用的技术分辨率更高，作者还鉴定出一些以前未报道的衰老相关基因（例如Apoc1、Caly、Cxcl12、Nell2和Ybx1等）。由于它们的表达水平有限或细胞数量较少，这些变化在过去的研究中可能被掩盖了。重要的是，单细胞DGE数据使研究者能够基于这些结果来确定这些衰老相关基因来自于特定细胞类型。例如，Ctss基因虽然在所有免疫细胞（MG、MAC、MNC和DC）中都高度表达，但仅在MG中随着衰老而发生显著变化。另一个例子是Nell2基因，它主要在神经元谱系细胞和OEG中表达，但其表达水平仅在OEG中随衰老而变化。然后，作者将分析的重点放在了11个主要细胞群体上，这些细胞群体表现出数量最多的差异基因（图2b）。通过比较这些细胞群体的DGE数据（图2c），鉴定了共有的和特定细胞类型的衰老标记基因。图2d中显示了多种细胞类型共有的衰老相关基因。大多数最常见的衰老上调基因是核糖体蛋白基因（例如Rpl6）、lncRNA基因（例如Malat1）和免疫调节或炎症基因（例如B2m）。最常见的衰老下调基因是线粒体呼吸链复合基因（例如mt-Nd1）、糖酵解相关基因（例如Aldoc）和编码硒蛋白的基因（例如Sepw1）。图2e中显示了特定细胞类型的衰老相关基因。有趣的是，这些数据表明，有些基因传统上被用于特定细胞类型随着衰老而变化的标记基因，例如OLG中Mog基因的下调，MG中Csf1r基因的下调，EC中Cxcl12基因的上调。相反，作者观察到一些经典特定细胞类型标记基因会随着其他细胞群体的衰老而变化。例如，在星形胶质细胞谱系和干细胞中高度表达的Gfap基因是EPC中上调最多的基因之一（图2e）。作者验证了一些共有的和特定细胞类型衰老相关基因表达的变化。如图3a所示，通过原位杂交验证了共有的衰老相关基因Rpl6、Malat1和Meg3基因的表达变化。通过流式细胞荧光分选技术（FACS）纯化的CD31+（EC）、CD11b+（MG）和ACSA-2+（ASC）细胞的普通RNA-seq分析和定量qRT-PCR分析，验证了特定细胞类型衰老相关基因Csf1r、Cxcl12和Sparc的表达变化（图3b，c）。此外，为了进一步确定本研究发现的基因转录变化是否与蛋白质水平变化一致，作者又进行了免疫组织化学分析。如图3d所示，正如单细胞scRNA-seq分析所揭示的一样，作者观察到了特定细胞类型MG中SPARC蛋白的下调与共有的衰老相关标记基因IL33蛋白的上调（图2e）。图3 共有的和特定细胞类型的衰老相关基因表达变化的验证。
测序数据还揭示了不同细胞类型中具有相反表达的基因。例如，四跨膜蛋白Cd9在OPC和ASC细胞中下调，但在EC和MG细胞中上调。通过双荧光原位杂交证实了OPC和MG细胞中这个双向衰老标记基因（图4a，b）。另一个例子是随年龄变化的双向衰老标记基因Cldn5，它常用作EC细胞的标记基因，但在OEG细胞中也高度表达。作者发现在EC细胞中Cldn5下调，而在OEG细胞中上调。值得注意的是，当在全脑中检测其表达水平时，它的变化很小，这进一步说明以前的测序研究掩盖了这些变化。同样，发现了许多基因在不同细胞类型之间不一致，例如核糖体蛋白基因。在主要细胞群体中共有的衰老上调基因中发现了许多核糖体蛋白基因（图2d），但是在某些特定细胞类型中，这些基因在衰老过程中也表现出不同的表达方向性。例如，Rps23基因在OPC和ASC细胞中下调，而在mNEUR、EC和MG细胞中上调。通过双荧光原位杂交在OPC和MG细胞中验证了这种双向衰老标记基因差异的表达特征（图4c，d）。当作者分析主要细胞群体中所有编码核糖体蛋白的基因表达谱时，发现了两种不同的表达模式。如图5a所示，在OPC和ASC细胞中均发现随着衰老而下调的一部分核糖体蛋白基因，在其他细胞类型中上调。当比较神经元亚型时，同样检测到了这些不同的表达模式，在GABA和GLUT神经元中发现随着衰老而上调的一部分核糖体蛋白基因，在DOPA神经元中下调。为了验证这些双向衰老相关标记基因的特征，检测了FACS纯化的ACSA-2+（ASC）、CD31+（EC）和CD11b+（MG）细胞中核糖体蛋白基因的表达。如图5b，c所示，通过普通RNA-seq分析再现了scRNA-seq分析的核糖体蛋白基因结果，突出了它们对衰老潜在的不同反应。通过基因集富集分析（GSEA）研究了衰老相关信号通路和细胞过程的变化。与DGE分析相比，GSEA具有更高的灵敏度，因为它可以汇总功能相关的大量基因信息。这样，在有限的细胞数量下能够分析细胞类型和神经元亚型，而在DGE分析中这些细胞类型和神经元亚型并未显示出明显的衰老相关变化。在所检测的细胞群体中，该方法揭示了许多共有的与特定细胞类型的衰老相关信号通路（图6）。共有451个信号通路发生了显著变化（P<0.05和q<0.25），在至少2种细胞类型中有234个，而其余217个在特定细胞群体中是独有的。在那些与衰老相关的信号通路中，有339个与细胞类型无关（上调195个，下调144个），而其余112个的变化在不同细胞类型中不同。最常见的衰老相关信号通路是细胞呼吸、蛋白质合成、炎症反应、氧化应激和生长因子信号（图6）。GSEA表明衰老过程中mNEUR细胞发生了许多生物学变化，包括关键代谢信号通路的损伤、离子稳态的失调和神经传递的扰乱。作者重点分析了两个尚未充分研究但很重要的大脑细胞种群EC和EPC的变化。GSEA分析显示EC细胞表现出许多衰老相关的信号通路变化，例如衰老和缺氧信号的诱导、酮信号传导的反应、异生代谢和脂质代谢以及激素处理的减少。在EPC细胞中，干扰素诱导的信号显著上调，这与某些干扰素刺激基因（如Ifitm3）的诱导相吻合。在FACS纯化的EPC细胞中，通过qRT-PCR也观察到了干扰素刺激基因和其他衰老诱导基因的上调。这一发现表明，衰老引起的炎症反应可能会延伸到这些细胞，并且看起来与已报道的脉络丛上皮细胞相似。重要的是，在不同细胞类型和神经元亚型中，GSEA分析还指出生物学过程中的核糖体生物发生表现出不同的衰老调节作用。绝大多数脑细胞类型都显示出与衰老相关的编码核糖体亚基基因的上调，而三种干细胞或祖细胞（NSC、NRP和OPC）显示其下调（图6）。单细胞转录组数据提供了探索衰老相关基因的表达变化影响大脑内细胞间交流的能力。通过利用每个细胞群体的转录谱，建立了一个几乎所有已识别的脑细胞类型之间潜在的配体-受体相互作用的综合网络。用DGE分析中的数据丰富了该网络来标记所有的相互作用，发现了随着衰老而变化的配体或受体表达水平。重点分析了EC细胞中的配体-受体的变化（图7），不仅是因为它们表现出如前所述的多种与衰老相关的变化（图2b，c），而且还因为它们拥有直接与大脑中合成的因子以及与周围组织分泌到循环中的因子相互作用的独特能力。分子网络分析表明，胱抑素C（Cst3，一个衰老下调的基因）和基质细胞衍生因子1（Cxcl12，一个衰老上调的基因）都是血管细胞与许多脑细胞间交流的调节基因（图7）。这一发现表明，它们的衰老相关变化可以协同或单独调节脑实质中衰老相关过程。在这项研究中，首先研究了小鼠大脑的细胞复杂性，并表明细胞身份和组成通常随着衰老而保持不变。更具体地说，当全部脑细胞比例量化时，发现大多数细胞类型中的细胞数量并不会随着年龄的增长而发生根本变化。尽管如此，作者确实观察到已报道与衰老相关的某些细胞群体（例如NRP）的下降。值得注意的是，针对此问题的其他工作可能会揭示出其他细胞亚型的变化，尤其是大脑特定区域的细胞。然后，比较了年轻细胞和老年细胞观察到某些细胞群体中明显的衰老相关的细胞间转录变异。但是，数据并未显示出所有细胞类型中普遍衰老相关转录变异的变化。特定细胞群体中的基因转录并不一定随着衰老而变化。这一发现与Warren等人的观点一致，但与其他研究相反，该研究表明转录变异的增加是衰老的共有特征。通过汇总所有单细胞测序并与已报道对小鼠衰老大脑的转录数据进行DGE分析，验证了许多已报道鉴定的衰老相关基因，并鉴定出一些以前未报道的衰老相关基因。然后，作者使用单细胞DGE分析揭示了主要细胞类型的标记基因。scRNA-seq的精细分辨率进一步使作者能够检测特定细胞群体中的基因表达变化，而这些变化被传统测序技术所掩盖。更具体地说，单细胞DGE分析产生了大量的衰老相关基因，这些基因（1）通常在细胞类型之间受到调节，（2）对某些细胞类型具有特异性，（3）在不同细胞类型间不一致。据作者统计，这些基因中只有一小部分在以前脑衰老研究中已报道。数据揭示了不同细胞群体的不同衰老模式。作者发现在不同细胞类型中某些与衰老相关的基因和信号通路受到差异调节。例如，随着年龄的增长，核糖体蛋白基因的表达在不同细胞类型和神经元亚型之间的表达相反。来自DGE和信号通路分析的数据均显示，大多数脑细胞类型均显示出衰老相关的核糖体蛋白基因上调，而在干细胞或祖细胞中下调。这种相反的双向衰老相关标记基因是值得注意的。在过去的几年中，已有研究表明，通过饮食限制而导致的蛋白质合成衰减或翻译相关基因（包括编码核糖体亚基的基因）的遗传操纵，会延长多种物种的寿命。值得注意的是，核糖体蛋白基因的下调和大量蛋白的合成一直被认为是衰老的标志。基于酵母的转录组学研究，衰老相关的核糖体蛋白基因的下调已被广泛接受。但是，在其他模式生物和人类中的多项研究却提出了相互矛盾的结果。Zahn等报道了人脑和肌肉组织中衰老相关核糖体蛋白基因的上调，在后续的研究中，发现小鼠神经元组织中衰老相关核糖体蛋白基因的上调，而多个非神经组织中相同基因的表达却下调。此外，最近发表的转录组学研究显示，与衰老相关的核糖体蛋白基因在ASC和NSC细胞中下调，并在中老年和患病大脑的MG细胞中上调。一项最新的研究表明，核糖体生物发生和活性的增加是人类成纤维细胞过早衰老的标志。对此的可能解释是，具有不同代谢需求的细胞受到衰老的影响不同，因此会诱导其他反馈回路，从而部分补偿翻译效率和蛋白质合成的损失。另一个解释是某些细胞群体可能会产生不同类型的核糖体来适应其翻译需求，以应对衰老引起的代谢变化。这些数据表明衰老过程可能并非在所有细胞类型中都是相同的，这与作者的发现以及最近对果蝇大脑转录组分析相一致，果蝇大脑的神经元和神经胶质的转录谱显示出不同的衰老轨迹。简而言之，尚不清楚核糖体蛋白基因和其他翻译相关基因的调节是否是衰老的原因或衰老后生理变化的结果，还是说两者都取决于物种、组织类型和细胞类型。但是，本研究表明核糖体生物发生是衰老相关途径之一，不同细胞类型受到不同调控。最后，通过生成配体-受体相互作用网络来创建大脑中细胞间交流的网络图，在几乎所有大脑细胞类型中配体-受体相互作用都会随着年龄的增长而变化。该网络图也非常重要，因为作者实验室和其他研究机构的最新发现表明，某些源自脑实质或血液的分泌因子也能够调节大脑衰老、变性和复苏。因此，新的因子、来源和靶标的发现是衰老领域中新兴的重要领域。通过结合血液蛋白质组学分析的数据、疾病模型以及异时共生实验的转录组数据来扩展该网络，这可能有助于确定新的由衰老和疾病引起的大脑功能缺陷的治疗靶标。本研究不仅揭示了细胞身份的差异，而且还揭示了经过不同治疗和状态（包括机体衰老）后一系列细胞类型的变化。随着单细胞测序技术的不断成熟，某些技术和实验限制也将得到改善。这些问题包括：（1）由大脑组织酶解而引起的潜在采样问题，可以通过单核测序方法解决；（2）对细胞解离、细胞包封和其他可能导致实验组之间转录差异的潜在年龄相关偏差；（3）与大脑的总大小相比，测序的细胞数量相对较少，从而限制了更多细胞群体的比较分析；（4）单细胞测序深度相对较低，将分析限制于高表达的基因上；（5）缺乏其他方法可以实现的转录本不同剪接体的分析。本研究数据不能揭示潜在的衰老相关的区域变化，并仅分析了雄性小鼠的大脑，但这可以通过空间转录组测序或性别特异基因表达变异来解决。尽管如此，本研究发现了几乎所有小鼠大脑细胞类型中与衰老相关的变化，并揭示了不同细胞群体中不同的衰老模式，并在本研究中进行了验证。因此，尽管在大多数细胞类型中都出现衰老的迹象，例如线粒体功能障碍和蛋白稳态丧失，但作者反对衰老是由所有细胞和组织中诱导单一分子进程的假设。但是，我们注意到衰老过程可能会逐渐发生或以不连续的步骤发生，具体取决于大脑中细胞间的复杂相互作用以及被外在因素（例如压力和运动）改变的相互作用。因此，未来的研究将通过检查其他时间点来探索连续的基因表达变化，这将有助于揭示每个细胞和基因的精确衰老轨迹，并有助于将引起衰老变化的原因与由于衰老变化的结果相区分。总之，作为神经科学界和研究衰老生物学的资源，研究者为所有小鼠大脑细胞类型提供了具有衰老相关的基因、信号通路和配体-受体相互作用的综合数据集。除了对衰老相关标记基因的探索和有关衰老过程的新颖见解之外，该数据还将被用作其他一系列研究的参考。例如，研究者揭示了许多特定细胞类型标记基因会随着衰老而变化。因此，在衰老的研究中，单一细胞的纯化或研究可能是错误的。同样，在许多细胞类型中，本研究数据显示某些看家基因的转录水平会随着衰老而变化，这可能会混淆一些定量分析。总体而言，这些数据将有助于推动对了解和调节衰老过程的研究，并探索与衰老相关的神经退行性疾病的分子和细胞治疗靶标。
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