【原】科研 | Journal of Hepatology：血吸虫miRNA通过靶向转化生长因子β受体Ⅲ促进宿主肝纤维化（国人作品）

编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。

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导读

血吸虫病是传播最广，最容易被忽视的的热带传染性疾病之一，影响世界78个国家的2.4亿人口。日本血吸虫分泌细胞外囊泡(EVS)，如外泌体，其中含有由寄生虫产生的miRNAs(sja-miRNAs)。有充分的文献证明，细胞外囊泡在细胞与细胞间的通讯或病原体与宿主的相互作用中发挥着重要作用。之前的研究已经表明，血吸虫的卵被释放到肝脏组织中，这会引起肉芽肿反应。在肉芽肿中，血吸虫卵被免疫细胞和其它肝脏间充质细胞包括肝星状细胞HSCs等包围并捕获。因此，在本实验开始之前，研究人员假设位于肉芽肿中心在卵内部的活的毛蚴分泌含有寄生虫miRNA的外泌体，这些外泌体可以进入HSCs的胞质溶胶（细胞质），进而激活HSCs细胞，引起肝纤维化。在本研究中，研究人员通过在血吸虫感染期间，宿主HSCs中始终存在sja-miR-2162证实了这个假设，该miRNA可以靶向宿主的转化生长因子β受体ⅢTgfbr3，参与宿主肝纤维化的跨物种调控。

论文ID

原名：A schistosome miRNA promotes host hepatic fibrosis by targeting transforming growth factor beta receptor III

译名：血吸虫miRNA通过靶向转化生长因子β受体Ⅲ（TGFBR3）的促进宿主肝纤维化

期刊：Journal of Hepatology

发表时间：2019年10月

IF：18.946

通讯作者：潘卫庆&张冬梅

作者单位：上海第二军医大学

实验设计

用RNA测序法检测日本血吸虫(sja-miRNAs)的miRNAs在肝星状细胞(HSCs)中的表达，将sja-miRNAs模拟物转染到HSCs中，对sja-miRNAs进行筛选。sja-miR-2162在肝纤维化中的作用被评估通过上调其在小鼠中的表达或通过给药（rAAV8）抑制其在小鼠中的表达。

研究示意图

结果

参与调控宿主肝脏纤维化的sja-miRNAs的鉴别

 

研究人员首先是从感染小鼠中分离原发性HSCs，通过RNA测序鉴定宿主HSCs中存在的sja-miRNAs，以确定可能参与宿主肝纤维化的sja-miRNAs。认真分析来自HSCs的 RNA样本，以确保宿主肝脏组织中来自寄主卵的RNA没有被污染。最后，对样本进行分析，确保来自寄主的两个高表达的基因不被检测到。研究人员鉴定了8个和在感染的HSCs中与血吸虫miRNA序列完全匹配的sja-miRNA。在8个sja-miRNAs中，有3个是寄生虫特异性miRNAs，包括sja-miR-2162，其余的都是保守的miRNAs，其种子序列与相应的宿主miRNA相同。采用qRT-PCR技术证实在感染HSCs中有这8个已鉴定的寄生虫miRNAs存在，而另外2个未在HSCs中存在的sja-miRNAs也未被检测到。

图1  过表达sja-miR-2162可造成小鼠肝纤维化

接下来，研究人员对可能调节肝纤维化的sja-miRNAs进行了筛选和鉴定。为此，研究人员合成了51个sja-miRNAs的模拟物，并将其转染到永生大鼠HSCs细胞株HSCs-T6中。试验鉴定出了17个sja-miRNA，包括sja-miR-2162，它们上调了纤维化相关基因的表达，如Col1α1、Col3α1，α-平滑肌肌动蛋白（α-Sma）；这些发现表明sja-miRNA可能调节肝纤维化（图3）。在已鉴定的参与肝纤维化的sja-miRNAs 中，sja-miR-2162也在宿主HSCs中检测到。此外，sja-miR-2162是唯一一个能上调所有检测到的HSCs激活相关基因的表达的寄生虫特异性miRNA。因此，研究人员选择sja-miR-2162进一步研究其在血吸虫病相关肝纤维化中的作用。

 

图2  sja-miR-2162抑制血吸虫所引起的肝纤维化

sja-miR-2162在调节宿主HSCs激活中的作用

 

为了研究sja-miR-2162在激活HSCs中的作用，研究者首先构建了表达sja-miR-2162的重组质粒。为了确定动物细胞是否能将嵌合体pri-sja-miR-2162加工成成熟的sja-miR-2162，研究者构建了携带萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因和海肾荧光素酶（Rluc）基因的sja-miR-2162传感器质粒（称为“传感器质粒”），该基因由sja-miR-2162靶位点的三个拷贝调控（原文图S4A）。两种质粒共转染293T细胞，Rluc/Fluc活性比值反映sja-miR-2162的生物活性。研究发现，与对照组相比，在没有表达质粒的情况下，Rluc活性降低（原文图S4B）。相反，与高浓度的表达质粒共转染导致Rluc活性降低，表明表达质粒在细胞系中产生成熟的sja-miR-2162，该细胞系通过靶向该miRNA的位点抑制Rluc基因的表达, 重要的是，将表达质粒转染到不同HSCs细胞系，如人、大鼠和小鼠HSCs显著上调Col1α1, Col3α1, and α-Sma的表达，表明sja-miR-2162在体外促进了HSCs的活化和胶原及ɑ-Sma的产生。

 

sja-miR-2162在促进感染小鼠肝纤维化中的作用

为了研究sja-miR-2162的表达是否能诱导小鼠肝纤维化，研究者使用了高嗜肝性重组腺相关病毒血清型（rAAV8表达pri-sja-miR-2162或乱序的-miRNA（SCR对照），将载体或PBS分别注射小鼠。在注射rAAV8-pri-sja-miR-2162后的40和100天，小鼠肝纤维化发生，与用SCR对照或PBS（图1B和1C）注射的小鼠相比，其特征是羟脯氨酸含量和纤维化相关基因的表达显著升高。Massons染色显示，细胞外基质（ECM）的沉积在注射后100天显著增加，但在注射40天后没有增加。进一步分离原代HSCs，检测Col1α1, Col3α1, α-Sma, Col4α1和Timp1 基因的表达。试验数据显示，与对照组相比，rAAV8-pri-sja-miR-2162注射小鼠的HSCs中所有这些纤维化基因的表达显著增加。这些结果表明sja-miR-2162在体内促进了肝纤维化。

关于sja-miR-2162可能对其他肝细胞的影响，研究者检测了注射rAAV8-pri-sja-miR-2162的小鼠中分离的肝细胞和Kupffer细胞，以寻找能够调节肝纤维化的基因。结果显示，sja-miR-2162在肝细胞和Kupffer细胞中均有表达。然而，sja-miR-2162的升高并没有改变肝细胞中TGF-β1, CTGF和IL-33等促纤维化因子的产生，也没有改变以iNOS、TNF-α, Arg1 和 TGF-β1为特征的Kupffer细胞分化，这意味着细胞中sja-miR-2162的存在对纤维化进程没有影响。

图3  sja-miR-2162与TGFBR3相互关系的验证

 

sja-miR-2162在血吸虫病肝纤维化中的作用

 

为了探讨sja-miR-2162是否参与了感染血吸虫病期间相关肝纤维化的进展，研究者构建了一个rAAV8-anti-sja-miR-2162的载体（称为“海绵载体”），该载体通过与miRNA结合，可抑制sja-miR-2162的功能（原文图S7A）。海绵载体对293T细胞株中sja-miR-2162功能的抑制作用得到验证（原文图S7B）。接下来，将小鼠暴露于用海绵载体或SCR控制载体处理的少量寄生虫中。感染后8周和10周，与注射SCR控制载体的小鼠相比，注射海绵载体的小鼠ECM沉积明显减少，羟脯氨酸定量和Massons三色染色显示了这一点。此外，H&E染色显示，用海绵载体处理的小鼠肝肉芽肿明显缩小。此外，通过H&E染色观察，用海绵载体治疗的小鼠肝肉芽肿的大小明显减小。基于qPCR的肝纤维化相关基因定量分析进一步证实了这种肝纤维化的减轻作用，结果表明，海绵载体处理的小鼠肝脏中胶原、α-Sma和Timp1的表达显著降低。与之前的研究结果一致，载体并不影响寄主体内寄生虫的存活或产卵。

接下来，研究者从小鼠中分离出原发性HSCs，以量化HSCs活化标记物的表达，并发现胶原、 α-Sma与注射对照载体或PBS的小鼠相比，注射海绵载体的小鼠的HSCs中的Timp1基因显著降低。为进一步验证sja-miR-2162在HSCs中的内化和促进纤维化，研究者还在感染后49天从感染小鼠中分离出原发性HSCs，并用sja-miR-2162抑制剂进行转染。结果显示，与阴性对照组（NC）相比，抑制剂显著降低了受感染HSCs中胶原、 α-Sma和Timp1的表达（图2H）。这表明抑制剂抵消了受感染HSCs中的sja-miR-2162，从而抑制了炎症相关基因的表达。这些数据表明，在血吸虫病发病过程中，寄生虫分泌的sja-miR-2162可以进入HSCs的胞浆，促进HSCs的活化和肝纤维化。

 

sja-miR-2162在寄主HSCss中通过寄生虫来源的外泌体进行内化作用

 

到目前为止，研究数据显示sja-miR-2162存在于宿主HSCs中，并在肝纤维化中发挥作用。接下来，研究者继续研究了血吸虫miRNA是如何传递到HSCs的。先前的研究显示血吸虫卵源性外泌体是高丰度的sja-miR-2162。基于这一发现，在本研究中，研究者分离了卵源性外泌体，并将其与来自小鼠的原代HSCs孵育。结果显示，外泌体促进了HSCs的活化，如胶原和 α-Sma的表达，而转染sja-miR-2 162抑制剂的HSCs部分阻断了外泌体介导的HSCs活化的作用，与NC相比，胶原和 α-Sma的表达显著减少。这些发现表明sja-miR-2162可能通过外泌体转运到HSCs的胞浆中。

 

sja-miR-2162-通过靶向TGFBR3基因介导宿主HSCs的活化

 

研究人员结合生物信息学分析和RNA测序筛选了HSCs中sja-miR-2162的靶基因。miRDB数据库预测了181个sja-miR-2162在小鼠体内的潜在靶基因，其中sja-miR-2162的靶位点位于其3’UTR处。RNA测序分析发现，与NC对照组相比，转染sja-miR-2162的原代HSCs中有324个上调的mRNA和470个下调的mRNA。只有两个靶基因由miRDB数据库预测的（Pcdh9和Tgfbr3）在RNA测序数据中显著下调。另外GO分析表明，下调的基因主要集中在“细胞外结构组织”、“细胞外基质组织”、“对创伤的反应”、“伤口愈合”等方面发挥作用。据报道，TGFBR3是TGF-β信号转导的负调控因子，在细胞外基质的产生和伤口愈合反应中起着重要作用。因此，在上述分析的基础上，研究者选择Tgfbr3作为潜在的靶基因进行进一步的研究。

图4  TGFBR3通过抑制SMAD信号阻断HSCs的激活

为了研究sja-miR-2162与Tgfbr3的关系，研究者首先分析了其在感染小鼠HSCs中的表达。结果发现，在感染期间，宿主HSCs中的sja-miR-2162的表达显著升高，并且在感染后40天达到高峰，相反，在感染期间，Tgfbr3 mRNA的表达显著降低，并且在感染后40天达到最低水平，这些研究表明sja-miR-2162和Tgfbr3 mRNA的表达呈负相关关系。为了检测Tgfbr3是否是sja-miR-2162的直接靶点，研究人员构建了一个携带萤火虫荧光素酶基因的载体，该载体融合到Tgfbr3 mRNA的3’UTR上，其中包含sja-miR-2162的假定靶点。293T细胞被该载体和sja-miR-2162模拟物或NC转染。结果表明，转染sja-miR-2162-mimics的细胞中的荧光素酶活性明显低于转染NC的细胞。相比之下，Tgfbr3 3’UTR的种子序列结合的5个核苷酸突变导致抑制完全消失。此外，用sja-pri-miR-2162表达质粒转染未感染小鼠的HSCs显著降低了Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达，而通过其抑制剂使受感染HSCs中的sja-miR-2162显著增加了Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达。实验还发现，用海绵载体处理的感染肝脏的原发性HSCss中Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达明显高于用对照载体处理的感染肝脏的HSCs。这些数据表明Tgfbr3是sja-miR-2162在宿主HSCs的直接靶点。

为了阐明Tgfbr3在HSCs活化中的作用，研究者将转化生长因子Tgfbr3 siRNA转染到小鼠原代HSCs中。结果发现，siRNA介导的Tgfbr3抑制剂明显促进了HSCs的活化，胶原和 α-Sma的表达升高就是证明（图4A）。与以往报道的Tgfbr3作为TGF-β/SMAD信号负调控因子的作用一致，研究发现转染Tgfbr3 siRNA或sja-miR-2162 mimics后，SMAD2和SMAD3的磷酸化明显增强。此外，研究者在用海绵载体处理的感染肝脏的原代HSCss中检测到磷酸化的SMAD2和SMAD3时，发现磷酸化SMAD2和SMAD3的水平明显低于对照载体（图4C），表明rAAV8介导的sja-miR-2162有效持续的抑制导致了TGFBR3的表达显著升高，从而降低了SMAD信号传导和胶原的产生。

讨论

本研究首次证实了寄生虫miRNAs在感染期间参与了血吸虫病相关肝纤维化的形成，其证据如下：（1）宿主HSCs中存在一种寄生虫特异性miRNA，sja-miR-2162，它通过靶向Tgfbr3基因促进宿主HSCs的活化；（2）通过将sja-miR-2162导入未成年小鼠肝脏促进体内肝纤维化；（3）通过降低胶原和ɑ-sma的产生有效和持续抑制sja-miR-2162减轻了感染小鼠肝的纤维化；（4）通过转染sja-miR-2162抑制剂减少纤维化相关基因的表达通过卵源性外泌体进入感染小鼠的HSCss或体外激活的HSCsS。因此，这些数据证明sja-miR-2162在血吸虫感染过程中直接调节HSCss的活化，除sia-mir-2162外，感染小鼠HSCs中还存在sja-Bantam和sja-miR-1等多种能促进HSCs体外活化的寄生虫miRNA，这些都值得进一步去研究。

TGF-β是各种器官中最有效的促纤维化细胞因子之一，通过与I型（TGFBR1）、2型（TGFBR2）和3型（TGFBR3）TGF-β受体的异聚物结合发挥其作用。配体结合后，TGFBR2激酶磷酸化胞质结构域，从而激活TGFBR，然后激活SMAD途径由于TGFBR3具有一个短的胞质结构域，其在TGF-β信号转导中的作用尚未被深入的研究。TGFBR3被认为是一种TGF-β共受体，它将配体集中在细胞表面，增强配体与TGFBR2的结合。然而，新的证据表明TGFBR3是TGF信号的负调节因子。例如，一项研究报告称，β-抑制素2介导的TGFBR3内吞抑制了TGF-β信号传导。此外，TGFBR3会发生细胞外基质脱落，释放可溶性胞外结构域（STGFBR3），有效中和TGF-β配体，从而减弱TGF-β/SMAD信号。此外，最近有大量证据表明TGFBR3是成纤维细胞活化和纤维化诱导过程中TGF-β信号的负调控因子。在本研究中，体外和体内实验表明，sja-miR-2162直接靶向Tgfbr3基因，从而下调其表达，导致HSCs活化，胶原和 α-sma表达增加。进一步的研究显示AAV8介导的对sja-miR-2162的有效和持续抑制导致了TGFBR3的表达显著升高，从而减少胶原的生成。此外，siRNA介导的Tgfbr3抑制剂显著增加了Smad2和Smad3的磷酸化，从而诱导肝纤维化。因此，本研究的数据似乎支持先前的发现，即TGFBR3是TGF-β信号的负调节因子。

阐明引起肝纤维化的机制是血吸虫病几十年来的主要研究目标。肝血吸虫病是一种免疫病理性疾病。卵子抗原诱导的2型免疫应答被认为是血吸虫病疾病进展的中心调节因子。此外，免疫应答过程中释放的促纤维化细胞因子，如IL-13和TGF-β1，可以通过SMAD途径促进HSCss的活化和肝纤维化。本研究在已报道的研究结果的基础上，进一步的研究发现，除了促生长的胞质分裂因子外，血吸虫miRNA sja-miR-2162还以跨物种的方式直接促进肝纤维化的发生。本研究所鉴定的sja-miR-2162是一种寄生虫特异性MIRNA，在日本血吸虫生命周期的各个阶段都高度表达，并在感染小鼠的肝组织和血清中检测到。因此，研究人员得出的实验数据为肝血吸虫感染的病理机制提供了新的见解，它扩展了广大研究者对病原体衍生的miRNA在其他传染病（如寄生虫病和真菌病）病理机制中的作用的理解，特别是其中参与的病原体分泌的miRNAs，促进各种疾病发生，如纤维化。因此，病原体衍生的miRNAs可能是一类在感染性疾病病理过程中起重要作用的通用调节因子，AAV8介导的对这些病原体衍生的miRNAs的有效和持续抑制可能是一种很有前途的治疗措施。

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