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编译：卡德加，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：Overexpression of a microRNA-targeted NAC transcription factor improves drought and salt tolerance in Rice via ABA-mediated pathways 译名：针对microRNA的NAC转录因子的过表达通过ABA介导的途径改善了水稻的干旱和耐盐性 期刊：RICE（1区） IF：3.513 发表时间：2019.10 通讯作者：庄楚雄 通讯作者单位：华南农大生命科学学院 DOI号：10.1186/s12284-019-0334-6 介绍 为了在环境胁迫下维持生长，植物往往依赖脱落酸(ABA)等激素，而脱落酸在整合多种胁迫信号和控制下游胁迫反应方面起着至关重要的作用。ABA生物合成和内源ABA水平在非生物胁迫下升高，干旱和盐胁迫是最重要的环境信号，上调ABA生物合成基因的转录水平。NAC (NAM, AFAT, CUC)家族是一类植物特异的转录因子，在水稻中已检测到151种。NAC转录因子在水稻非生物胁迫反应中的作用已被广泛研究，有报道称一些水稻NAC基因具有非生物胁迫耐受功能，例如OsNAC5的过表达，OsNAC6，OsNAC9，OsNAC10或OsNAP提高了转基因水稻的耐旱性和耐盐性。 已有研究报道OsNAC2在水稻中具有重要作用。在启动子激活标记突变体中，OsNAC2表达的增加导致水稻分蘖角的增加，此外，OsNAC2与株高相关，并能促进叶片衰老和增产。在本研究中，研究者发现过表达miR164b抗性形式的OsNAC2的植株比野生型(WT)具有更高的耐旱性和耐盐性，而且转基因植株的ABA含量有所增加。研究者还发现，与野生型相比，ABA生物合成基因和胁迫响应基因的表达量增加。 结果 过表达OsNAC2会减缓种子萌发 在之前的研究，研究者发现了耐miR164b的mOsNAC2过表达系ZUOErN3和ZUOErN4。在本研究中，发现了ZUOErN3和ZUOErN4的萌发速度明显慢于对照WT种子(图1a-c)。在3天的吸胀过程中，研究者观察到WT的种子相较两个细胞系发芽更多。萌发后5天(图1b)、7天(图1c)，幼苗间差异明显，例如，WT幼苗比过表达植株高。吸吸90h后，WT种子和转基因种子的总发芽率无明显差异，各品系发芽率均达到95%以上(图1d)。以上结果表明，过表达的种子发芽速度慢于WT种子，但总体发芽率无差异。 研究表明，种子中ABA含量的增加会减慢种子发芽，而ABA含量的减少则会加速种子发芽。为了探讨种子发芽率的变化是否与种子发芽率的变化有关，在种子萌发过程中，研究者对WT种子施用了不同数量的ABA。当ABA浓度达到2.5μmol / L时, WT种子的发芽率类似于转基因种子。结果表明，外源ABA的添加降低了WT种子的发芽率。 ABA是一种来源于类胡萝卜素的植物激素。氟啶草酮(FLU)可抑制类胡萝卜素的生物合成，从而影响ABA的生物合成。当80μmol/L FLU被应用于种子萌发，两天之后WT和过表达植物的表型并没有显著差异，发芽后第3天和第5天，幼苗的长度仍然没有显著差异。因此，抑制内源ABA生物合成可以使WT和过表达种子的萌发速度和幼苗生长速度相似。随后研究者使用放射免疫分析法(RIA)方法研究种子中内源性ABA的含量。WT种子ABA水平为72.1±2.2 ng/g，而显著高于转基因种子中的ZUOErN3(131.6±4.4 ng/g in)和ZUOErN4(120.4±13.3 ng/g)。这进一步支持了在过表达植株中增加ABA含量会延迟发芽的结论。 图1 过表达mOsNAC2的种子比WT种子发芽慢。种子先用蒸馏水浸泡48小时，然后在25/23℃(白天/晚上)的培养皿中发芽。在吸胀后的不同时间计算发芽率。分别于3 d (a)、7 d (b)、9 d (c)水自吸后拍摄，(d)为水吸后发芽率。WT:野生型的种子; ZUOErN3和ZUOErN4: OsNAC2过表达系。 过表达mOsNAC2的植株具有更高的耐旱性 植物ABA含量与干旱等胁迫的耐受性有关。研究者在过表达mOsNAC2的种子中检测到更高的ABA含量(图2a)；因此，研究者探讨了是否mOsNAC2过表达的植物在使其两周龄的幼苗处于聚乙二醇(PEG)诱导的干旱条件下，提高了它们的耐旱性。PEG处理前WT、ZUOErN3、ZUOErN4幼苗表型相似(图3a、e)，处理3天后WT植株叶片卷曲、萎蔫，脱水症状明显(图3b, f)，而ZUOErN4和ZUOErN4的叶片表现出有限的干旱胁迫症状(图3 b, f)。经过8天的干旱处理和8天的恢复，WT植株大部分枯萎死亡，而过表达的植株则呈现出绿叶(图3c，g)。ZUOErN3和ZUOErN4分别为69.2±8.8%和66.3±7.9%，WT株为11.2±3.1%(图3d)。结果表明，过表达OsNAC2可显著提高苗期抗旱性和成活率。 图2 转基因种子和经过干旱处理的幼苗的ABA水平升高。PEG处理水稻种子(a)和幼苗中的ABA水平(b)。幼苗在10% PEG 6000的水培溶液中培养，模拟干旱。** P < 0.01 (t检验)。 研究者进一步研究了分蘖期的耐旱性。15% PEG处理5天，恢复7天，转基因植株比WT植株更健康。转基因植株长出新叶，而WT仅恢复绿色(图3h)。这些结果表明分蘖期转基因植株的耐旱性也高于野生型。为了研究过表达mOsNAC2的植株对盐胁迫的响应，对幼苗进行了50mM NaCl的处理。经过八天的处理后，大部分WT树叶枯萎和死亡，而只有少数的转基因植物的叶子已经死亡，且有新叶开始生长(图4a,b,d,e)。一个为期八天的恢复期后，大部分的WT植物都已死亡，而所有的转基因植物有新叶生长(图4c,f)。RT-PCR的结果也表明OsNAC2能有效提高水稻的耐盐性。 图3 WT和OsNAC2过表达植株的耐旱性。种子在水中发芽，然后转移到Kimura B营养液中。两周龄幼苗在含有10% PEG 6000的Kimura B营养液中处理。处理前(a, e)，10% PEG处理3d (b, f)，处理后8d，然后恢复8d (c, g)。d: 10% PEG 6000处理的WT和转基因株系在c和g中的存活率。 图4 WT和OsNAC2过表达植株的耐盐性。种子在水中发芽，然后转移到木村B营养液中。两周龄幼苗在木村B营养液中加入50mM氯化钠处理。WT和OsNAC2过表达植株(ZUONrE3和ZUOErN4)处理前(a, d), 50mM氯化钠处理8 d (b, e)，然后恢复8 d (c, f)。 过表达mOsNAC2植株的ABA的生物合成基因表达增加 类胡萝卜素脱氢酶(NCEDs)是ABA生物合成的关键酶。OsNCED1主要在正常条件下的水稻叶片中表达。RT-qPCR分析结果表明，在正常生长条件下，转基因植株中OsNCED1的表达明显高于WT(图5a)。OsNCED3是水稻干旱胁迫下促进ABA生物合成的主要基因，研究者的RT-PCR结果显示ZUOErN3系和ZUOErN4系的含量分别比野生型高0.99倍和1.04倍(图5b)。研究者还分析了ABA生物合成中另外两种重要酶的编码基因的表达，即黄嘌呤脱氢酶(OsABA2)和玉米黄质环氧酶(OsZEP1)，然而这两个基因在转基因植株和WT植株之间的表达水平没有显著差异(图5c, d)。这些结果表明，某些ABA生物合成基因如OsNCED1和OsNCED3的表达增加可能导致转基因植株中ABA含量升高。 为了确定ABA是否参与了ZUOErN3和ZUOErN4的抗旱性增强，研究者测定了PEG处理后的幼苗的ABA浓度。在干旱处理前，转基因大豆(ZUOErN3和ZUOErN4)中的ABA含量和WT分别为115.6±2.5、110.6±15.1，鲜重为51.0±9.3 ng/g(图2 b)。PEG处理后，转基因植株和WT植株的ABA含量均有所增加，但转基因植株的ABA含量在1、2和3天处理后均显著高于WT植株(图2 b)。这些结果表明，转基因植物中较高的ABA水平可能有助于提高它们的耐旱性。 胁迫反应基因在过表达mOsNAC2的植株中表达量较高 为了进一步研究OsNAC2调控应激相关基因表达的机制，研究者采用RT-qPCR技术对WT和mOsNAC2过表达的株系中几种重要的非生物应激响应基因进行了检测。干旱诱导基因OsLEA3(编码后期胚胎发生蛋白)的表达，在转基因植株中的表达量是原先2倍多，而ABA应答基因OsRAB16(编码一个小的GTP结合蛋白)的表达量是4倍多(图6)。脯氨酸是最著名的渗透保护剂之一，其积累已在生物体内广泛观察到，在转基因植株中，脯氨酸生物合成基因OsP5CS1的表达约为正常植株的0.7倍，而OsProt的表达没有显著变化(图6)。这些结果表明，OsLEA3，OsRAB16和OsP5CS1参与了干旱和盐胁迫反应。 图6 非生物应激相关基因表达水平。编码a组3后期胚胎发生丰富蛋白的OsLEA3的相对表达水平；OsP5CS，参与脯氨酸的生物合成，编码Δ1-pyrroline-5-carboxylate合成酶；编码脯氨酸转运蛋白的OsProt；和OsRab16编码一个小的GTP结合蛋白，利用RT-qPCR对幼苗检测。利用水稻UBI基因对数据进行归一化处理，并与WT进行对比。 OsNAC2直接调控OsNCED3和OsLEA3的表达 本研究中，过表达mOsNAC2的幼苗的OsNCED3和OsLEA3的表达水平明显高于WT，研究者推测这两个基因可能是OsNAC2的靶点。为进一步研究OsNAC2的候选靶点，对OsNAC2与OsLEA3和OsNCED3的启动子结合进行了酵母单杂实验。将不同长度的启动子序列连接到pAbAi载体上。酵母单杂交实验表明，OsNAC2直接与OsLEA3和OsNCED3的启动子相互作用(图7)。 图7 OsLEA3和OsNCED3是OsNAC2的直接靶基因。将全长OsNAC2 cDNA融合到猎物载体的GLA4激活域。将不同长度的启动子序列区域融合到饵料载体的AbAi报告基因中。 讨论 NAC TFs在水稻抗逆性中起重要作用。在本研究中，研究者发现OsNAC2是一种积极的非生物胁迫耐受调节因子，因为过表达mOsNAC2的水稻植株对干旱和盐胁迫的耐受性增强。此外，之前的研究发现过表达mOsNAC2的植物具有理想的植物结构，如茎粗、根系发达、产量高。高度发达的根系可以从土壤中吸收更多的水分和营养，从而获得更好的耐旱性和促进更高的产量。在非生物胁迫条件下，其他几种NAC TFs也能提高水稻产量。OsNAC10在胁迫条件下提高水稻产量。过表达OsNAC5的水稻也提高了抗旱性，提高了干旱条件下的粮食产量。OsNAC5与水稻的非生物胁迫诱导基因OsLEA3相互作用，OsLEA3在水稻的抗旱性和耐盐性中起重要作用，类似于本研究观察到OsNAC2与OsLEA3启动子结合的直接作用。研究者还发现了耐miR164b的过表达mOsNAC2的植物对干旱和盐胁迫的耐受性增强，部分原因是它们对OsLEA3的直接调控。 ABA在植物胁迫响应调控中起着重要的作用。NAC基因家族中的许多基因都能增强抗应激能力，这与ABA密切相关。在本研究中，过表达mOsNAC2的植株表现出了更强的耐旱性和耐盐性，进一步的测定表明其ABA含量明显高于WT。在ABA生物合成中编码限速酶的OsNCED1和OsNCED3的表达水平在转基因植株中也显著高于野生型。这些发现表明OsNAC2调控ABA生物合成基因的表达，增加ABA含量，从而提高非生物胁迫耐受性。此前有报道称OsNAC2直接促进OsNCED3的表达，增加ABA含量，研究者还证明了在酵母单杂交系统中，OsNAC2直接与OsNCED3的启动子相互作用，支持了之前报道的结果。 与野生型相比，在过表达mOsNAC2的植株中，几种非生物胁迫响应基因的表达水平明显升高。这些基因包括OsLEA3，编码a组3-后期胚胎发生丰富蛋白；OsRAB16，编码一个小的GTP结合蛋白；和OsP5CS1，编码羧酸盐合成酶，一种酶参与脯氨酸的生物合成。这种表达的增加表明这些过表达mOsNAC2植株的耐受性增强也可能与脯氨酸水平和这些介导非生物胁迫耐受的候选蛋白有关。事实上，脯氨酸积累可能是渗透胁迫耐受的一个指标，因为它参与调节植物细胞质的渗透压力。此外，Rab家族蛋白在植物对环境胁迫的耐受中起着重要的作用。OsRAB16是一个ABA响应基因，过表达mOsNAC2的植株的表达量是WT的四倍以上，这与转基因植株中ABA水平的升高一致。最后，OsNAC5直接与OsLEA3的启动子相互作用，本研究证明了OsNAC2直接与OsLEA3的启动子相互作用来调节干旱和耐盐性。 NAC TF蛋白在水稻生长发育过程中起着重要的作用，每个NAC TF蛋白都扮演着多种角色，例如，NAC TF OsNAP可以调节叶片衰老，并在营养和生殖阶段提高非生物胁迫耐受性。当OsNAC5和OsNAC10在根中特异性表达时，可以改变根系结构，提高抗旱性，从而提高干旱条件下的产量。综上所述，OsNAC2在水稻的生长发育中具有几个重要的功能，特别是在提高产量方面。本文中，研究者证明了OsNAC2通过ABA介导的途径对水稻的耐干旱和耐盐性起着积极的调节作用，这些发现可能为培育新的耐胁迫高产水稻品种提供了可能。 结论 研究者的结果表明，OsNAC2通过ABA调节通路正向调节水稻对干旱和盐胁迫的耐受性。本研究增加了我们对水稻对干旱和盐胁迫反应的分子机制的了解，拓宽了对水稻NAC TF功能的认识。这一信息将有助于利用基因工程技术培育抗旱耐盐水稻品种。 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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