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题目：Abscisic acid promotes auxin biosynthesis to inhibit primary root elongation in rice 刊名：Plant Physiology 作者：Hua Qin，Rongfeng Huang et al. 单位：Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 日期：19 December 2022    01 摘要  土壤板结是一个全球性问题，会导致作物生根不充分和产量低下。越来越多的证据表明，植物激素通过调节不同组织中的特定生长过程来协调调节根系生长。然而，在适应不同土壤环境的过程中，脱落酸 (ABA) 信号如何转化为生长素产生以控制根系生长仍不清楚。在这项研究中，我们报告说 ABA 对水稻初生根生长具有双相效应（Oryza sativa) 通过生长素生物合成介导的过程，抑制根伸长并促进根肿胀响应土壤压实。我们发现 ABA 处理诱导了生长素生物合成基因的表达和根中生长素的积累。相反，阻断生长素生物合成降低了根对 ABA 的敏感性，显示出更长更细的初生根，根分生组织尺寸更大，根直径更小。进一步研究发现，参与ABA信号传导的转录因子碱性区和亮氨酸拉链46（OsbZIP46）可直接结合YUCCA8 /水稻乙烯不敏感7（OsYUC8/REIN7）启动子激活其表达，遗传分析表明OsYUC8/REIN7位于OsbZIP46下游. 此外，ABA 或生长素生物合成缺陷的突变体的根表现出增强的穿透压实土壤的能力。因此，我们的结果揭示了 ABA 使用生长素作为下游信号来改变根系伸长和径向扩张的机制，导致根系短而肿胀，影响其穿透压实土壤的能力。这些发现为育种者选择能够抵抗土壤压实的作物提供了途径。 02 技术路线  水稻 ( O. sativa ) rein7-1、taa1、mhz5、DR5-GUS转基因品系和OsbZIP46-CA1过表达品系 土壤压实实验 Rt-qPCR β-葡萄糖醛酸酶 (GUS) 染色 Vibrotome 和共聚焦成像 染色质免疫沉淀 (ChIP)-qPCR 测定 电泳迁移率变动 (EMSA) 测定 荧光素酶瞬时表达测定 IAA 含量测量 03 主要结果 3.1 ABA抑制根伸长并促进根膨胀以响应土壤压实 研究发现，土壤压实通过限制乙烯扩散抑制根系生长，而ABA在乙烯下游的作用是抑制根系生长。为了探索这一假设，我们首先观察了在压实和未压实土壤中生长的根。与之前的报告一致，土壤压实显著抑制根系生长（图1，A和B）。为了进一步阐明土壤压实对根生长的抑制作用的细胞基础，我们制备了根尖和成熟区的纵向和横向截面，并用碘化丙啶（PI）染色。与在未压实条件下生长的根相比，在压实土壤中生长的根在根分生组织大小（~13%）、分生组织区细胞数（~15%）和成熟区细胞长度（~21%）方面显著减少，根直径（~19%）增加（图1，C–G），表明土壤压实对根生长具有双相影响，即：抑制根伸长和促进根膨胀，土壤压实对根伸长的抑制是由于分生组织中的细胞分裂减少和成熟区中的细胞伸长。 最近的证据表明，ABA 处理抑制细胞增殖并促进根分生组织中皮质细胞的自由基扩张，这与土壤压实的影响相似，表明 ABA 可能在土壤压实调节根系生长中发挥作用. 因此，我们进一步研究了 ABA 对根系生长的影响。我们的结果表明，外源 ABA 处理导致根长 (~33%)、分生组织大小 (~26%)、分生组织区细胞数 (~20%) 和成熟区细胞长度 (~33%) 的减少，以及根直径增加 (~27%) (补充图 S2，A–G和三、A 和 B），它模拟了土壤压实的影响。这些结果表明 ABA 可能参与压实土壤条件下的根系生长。对水稻 ABA 生物合成突变体mhz5的进一步研究表明，在压实土壤中生长时， mhz5的根系抑制作用低于野生型（图 1，H 和 I）。这些结果表明 ABA 是响应土壤压实条件的根系生长所必需的。
3.2 破坏生长素生物合成会削弱根系对 ABA 和土壤板结的反应 众所周知，生长素在植物根系生长发育中起着关键作用。因此，我们想知道 ABA 抑制水稻根系伸长是否也需要生长素的作用。为了解决这个问题，我们使用了DR5-GUS水稻品系，该品系被开发用于绘制植物组织中生长素的分布图。外源性 ABA 处理增强了分生组织区 (MZ)、伸长区 (EZ) 和分化区 (DZ) 中的 GUS 活性（图 2，A 和 B）。相应地，ABA处理后生长素生物合成基因的表达和IAA含量增加（图2，C和D），表明ABA通过激活生长素生物合成基因的表达诱导根部生长素的积累。
接下来，我们在存在 yucasin（一种 YUC 活性抑制剂）或 L-Kyn（一种有效的 TAA1/TAR 活性抑制剂）的情况下用 ABA 处理幼苗。我们的观察表明，野生型幼苗中 ABA 抑制的根伸长被 yucasin 或 L-Kyn 拯救（图 2，E 和 F），这表明 ABA 抑制的根伸长需要完整的生长素生物合成。为了进一步证实这一点，我们检测了ABA 处理下水稻生长素生物合成突变体taa1和rein7-1 的根表型。他们都表现出对 ABA 的敏感性降低（图 3，A 和 B）。对根的纵向和横向切片的分析表明，ABA 处理导致根分生组织大小 (~18%–20%) 和分生组织区细胞数 (~24%–26%) 的减少，以及根直径的增加 (~ 17%–35%)，而这种趋势在taa1和rein7-1根中减弱了（图 3，C–G和补充图 S4，C-G）。这些结果表明，ABA 抑制根伸长并促进依赖于局部生长素生物合成的根肿胀。
ABA 介导根系生长以响应土壤压实以及taa1和rein7-1根对 ABA 的敏感性降低的结果启发我们研究生长素是否参与 ABA 介导的根系响应土壤压实的生长。我们首先研究了土壤压实对taa1和rein7-1根系生长的影响。我们的结果表明，在压实土壤条件下生长时， taa1和rein7-1根的根长没有显着减少（图 4，A 和 B）), 这表明生长素对于在土壤压实时触发根系生长反应至关重要。进一步检测表明，生长素生物合成基因的表达和IAA含量在压实土壤中生长的野生型根中增加，但在mhz5根中这种趋势减弱（补充图 S5，A 和 B）。这些结果表明，在土壤压实条件下，ABA 介导的根系生长需要生长素。
3.3 OsbZIP46正调控根中对ABA的反应 bZIP 转录因子是 ABA 核心信号中 SnRK2 蛋白激酶的主要靶标，在激活植物 ABA 依赖性基因表达方面发挥重要的调控作用（Tang 等人，2012 年；Zong 等人，2016 年；Chang 等人，2017年） ). 由于 OsbZIP46 是 ABA 信号和抗旱性的关键调节因子（Tang 等人，2012 年；Ma 等人，2019 年），我们提出 OsbZIP46 可能参与 ABA 激活的生长素生物合成基因表达。为了证实这种可能性，我们通过 CRISPR–Cas9 生成了OsbZIP46 ( osbzip46 )的功能缺失突变体，这一点已通过对靶基因进行测序得到证实。osbzip46-1 _突变体在编码区包含 1-bp 插入，分别触发开放阅读框的移码，导致提前终止。osbzip46-2和osbzip46-3敲除品系在目标基因的编码区包含 1-bp 和 4-bp 缺失，导致开放阅读框的移码和过早终止密码子的产生（补充图 S6，A 和 B）。我们还生成了包含在CaMV35S启动子控制下的OsbZIP46编码区的过表达 (OE) 系，目标基因的表达增加通过 RT-qPCR 得到证实（补充图 S6C）。 随后，我们检查了转基因植物的 ABA 敏感性。在没有 ABA 的情况下， osbzip46突变体和过表达株系的根长与野生型相似（补充图 S7，A–C）。ABA 处理后， osbzip46突变体对 ABA 的敏感性降低，而过表达株系的根系比野生型短得多（补充图 S7，A–C）。纵向和横向根尖切片显示，ABA 处理显着降低了分生组织大小和分生组织区细胞数量，并增加了所有幼苗的根直径，而 osbzip46 突变体的根直径增加较低 (~12%–17% )和与野生型相比，OsbZIP46 过表达品系显示出分生组织大小 (~30%–35%) 和分生组织区细胞数 (~30%–37%) 以及根直径增加 (~56%) 的下降幅度更大根（分生组织大小减少约 21%，分生组织区细胞数量减少约 26%，根直径分别增加 36%）（图 5，A-E). 这些结果表明 OsbZIP46 通过减少水稻根分生组织中的细胞分裂和增加根直径来正向调节根中的 ABA 反应。 之前的研究表明，天然的 OsbZIP46 没有反式激活活性，OsbZIP46 D 结构域的缺失导致组成型反式激活活性。因此，我们进一步检查了OsbZIP46-CA1过表达幼苗的 ABA 敏感性，这些幼苗是通过过表达结构域 D 缺失的 OsbZIP46 组成型活性形式产生的。在正常条件下， OsbZIP46 -CA1过表达的幼苗根明显短于野生型根。在 ABA 处理后， OsbZIP46-CA1过表达的幼苗根表现出 ABA 敏感性增加，表明 OsbZIP46 是 ABA 信号的正调节因子，具体取决于其激活。 接下来，我们检查了osbzip46突变体、OsbZIP46过表达幼苗和OsbZIP46-CA1过表达幼苗响应土壤压实的根表型。土壤压实显着降低了野生型幼苗的根长，在osbzip46突变体中具有较温和的表型，在OsbZIP46和OsbZIP46-CA1过表达幼苗中具有更明显的表型（补充图 S9，A-D），表明 OsbZIP46 介导的途径部分需要调节土壤压实诱导的根系生长抑制。
图5 OsbZIP46 正调节 ABA 调节的根伸长和根肿胀。 （A 和 B）使用或不使用 0.5 μM ABA 处理的 4 天 Nip、OsbZIP46 敲除和过表达幼苗的根尖纵切面 (A) 和根伸长区径向切面 (B) 的代表性碘化丙啶染色。 (C–E) 根分生组织区的长度 (C) 和皮质细胞数 (D) 以及面板 (A) 和 (B) 中所示的相应幼苗的根直径 (E)。 3.4 OsbZIP46通过直接结合其启动子激活OsYUC8/REIN7的表达 OsbZIP46 正调控根中ABA 反应和ABA 诱导生长素生物合成基因的表达和根中生长素积累的数据促使我们检查OsbZIP46 是否调控根中生长素生物合成基因的表达。为了验证这一点，我们检测了osbzip46突变体、OsbZIP46和OsbZIP46-CA1过表达幼苗根中TAA和YUC基因的表达。我们的结果表明， YUC2、YUC3、YUC8/REIN7和TAA1的表达受 OsbZIP46 调控（图 6A），暗示YUC2、 YUC3、 YUC8/REIN7和TAA1可能是 OsbZIP46 的潜在目标。 先前的研究表明，bZIP 超家族转录因子优先结合目标基因上游的 G-box 以调节下游基因表达。然后我们分析了YUC2、YUC3、YUC8/REIN7和TAA1的启动子序列，并在YUC8/REIN7启动子中鉴定了三个 G-box (5'-CACGTG-3') （图 6B）。因此，我们使用带有 myc 标记的 OsbZIP46 (OsbZIP46-myc) 的转基因植物进行了染色质免疫沉淀 (ChIP) 测定。如图6C所示，OsbZIP46 在YUC8/REIN7的 P3 片段中显着富集启动子，而其他片段没有显着富集（图 6C）。随后，我们使用重组 OsbZIP46 蛋白进行了电泳迁移率变动分析 (EMSA)。结果显示OsbZIP46与YUC8/REIN7启动子的P3片段结合，但不与突变的G-box (5'-AAAAAA-3')的DNA探针结合(图6D )。非生物素标记的 DNA 片段有效地与结合竞争（图 6D）。这些结果表明 OsbZIP46在体内和体外直接与YUC8/REIN7启动子结合。 为了确定 OsbZIP46 是否激活YUC8/REIN7的表达，我们进行了瞬时表达测定，其中我们将YUC8/REIN7的 ATG 密码子上游的 4,500-bp 启动子序列与荧光素酶( LUC ) 报告基因融合，并共转染水稻原生质体含有35S:bZIP46或35S:bZIP46CA1的效应质粒。与对照载体相比，全长 OsbZIP46 蛋白对YUC8/REIN7启动子驱动的 LUC 活性没有明显影响，而 OsbZIP46-CA1 显着提高了 LUC 活性水平（图 6E), 这与之前的报道一致，即天然 OsbZIP46 蛋白不能激活下游基因的表达。总之，这些结果表明 OsbZIP46 直接结合YUC8/REIN7的启动子以激活其表达。
3.5 YUC8/REIN7在 ABA 控制的根系生长中发挥OsbZIP46下游的功能 为了探索OsbZIP46和YUC8/REIN7之间的遗传关系，我们首先通过将rein7-1与bzip46-1杂交产生双突变体。未经 ABA 处理， rein7-1 bzip46-1双突变体的根长与rein7-1突变体和bzip46-1突变体的根长相似（补充图 S11，A–C）。通过 ABA 处理， rein7-1、 bzip46-1和rein7-1 bzip46-1双突变体的根均显示出对外源 ABA 的敏感性降低（补充图 S11，A–C）。相应地，与 ABA 处理相比， rein7-1 bzip46-1双突变体在分生组织大小 (~8%)、分生组织区细胞数 (~6%) 和根直径增加 (~7%) 方面表现出较低的下降幅度与野生型（分生组织大小减少约 23%，分生组织区细胞数量减少约 21%，根直径增加约 30%–39%，分别），类似于 rein7-1 突变体（图7， A –E）。这些结果表明OsbZIP46和YUC8/REIN7最有可能在 ABA 调节的根生长的相同途径中发挥作用。 为了进一步检查OsbZIP46和YUC8/REIN7之间的遗传关系，我们随后分析了通过将rein7-1与bZIP46-OE-1杂交获得的rein7-1 bZIP46-OE-1植物的 ABA 反应。当暴露于 ABA 时，rein7-1和rein7-1 bZIP46-OE-1纯合植物的根比野生型和bZIP46-OE-1幼苗受到的抑制程度更低（补充图 S11，A–C）。根尖的解剖学分析表明， rein7-1和rein7-1 bZIP46-OE-1植物在 ABA 处理下比野生型和bZIP46-OE-1幼苗具有更大的根分生组织尺寸、更高的分生组织区细胞数和更小的根直径（图 7，A–E）。这些数据表明， YUC8/REIN7作用于OsbZIP46的下游，并且YUC8/REIN7介导的途径是 OsbZIP46 信号转导调节 ABA 调节的根生长的部分需要。
 04 结论 压实的土壤限制了乙烯的扩散，导致 OsEIL1 在根部积累，通过YUC8/REIN7直接上调生长素生物合成。表皮细胞中较高的生长素水平会抑制表皮细胞伸长，从而导致分生组织尺寸减小和根伸长受到抑制。同时，OsEIL1 还激活皮质细胞中的 ABA 生物合成，导致根皮质细胞径向扩张和根肿胀。较高的 ABA 介导 OsbZIP46 激活YUC8/REIN7的表达，促进生长素生物合成，进一步抑制表皮细胞伸长和根伸长，最终导致根短而肿（图 8). 我们的研究结果揭示了根系如何通过乙烯介导的生长素和 ABA 生物合成上调来适应土壤压实的机制见解，这在先前研究的基础上进一步丰富了根系发育的调控网络 。
05 原文获取 原文链接： https://academic./plphys/advance-article/doi/10.1093/plphys/kiac586/6936590?login=false PDF获取： https://www./h-nd-171.html |
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