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编译：小北，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 近年来肿瘤发展显著增多，有望随着期望寿命的增高持续增长。不同的癌症治疗方法优化结合为治疗癌症开辟了新的途径，例如基于NK细胞的免疫疗法。NK细胞上的功能抑制受体是健康细胞抵御攻击所必需的。然而破坏NK细胞上抑制受体的功能却增加了NK细胞的免疫毒性。MicroRNA是小的非编码RNA，能够靶向mRNA进而调节NK细胞发育、成熟以及效应器相关基因的表达。靶向miRNAs调节效应有望提高肿瘤免疫疗法的有效性。越来越多的证据也表明一些miRNA能够直接或者间接地控制NK细胞及其配体在免疫检测点处相关基因的表达，这也提示了miRNA能够靶向肿瘤治疗。本文通过论述miRNAs和NK细胞功能调节之间的联系，进一步讨论了miRNAs在肿瘤免疫疗法中作为生物标记物的潜在可能性。 论文ID 原名：miRNAs in NK Cell-Based Immune Responses and Cancer Immunotherapy 译名：基于NK细胞的免疫反应和癌症免疫疗法中的miRNA 期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology 影响因子：5.206 发表时间：2020年2月25 作者： Silvia Pesce 单位： 热那亚大学 DOI：10.3389/fcell.2020.00119. 结果 miRNAs是基因表达的重要调节因子 目前大约有2000个miRNA在人体内被识别，这些小的RNAs起源于RNA聚合酶Ⅱ转录的Pri-miRNAs，Pri-miRNAs经历一系列的步骤成熟。在细胞核内由DGCR8区域的核糖核酸酶 III Drosha切割成70-120个核苷酸长度的小发卡中间体。经输出蛋白5转运至细胞质后，Pre-miRNAs被核糖核酸酶 III Dycer加工成大约22个核苷酸长度的双链成熟miRNAs，一条链缠绕miRNA引起的沉默复合体RISC中的argonaute蛋白。这些复合体能够促进miRNA的核苷酸序列与mRNAs的3端UTR配对同时RISC的辅因子能够调节特异位点分裂、靶向mRNA的降解以及抑制蛋白翻译。众所周知，miRNA能够抑制数以百计的不同mRNA，且靶向的序列可能存在于单条mRNA的3端UTR，因此miRNA的复合协调作用可能影响许多mRNA的稳定性和翻译。由于miRNA识别序列出现在人类蛋白编码的mRNAs中，这使得miRNA作为基因表达的调节因子在哺乳动物生理和病理的发育过程中发挥重要作用。因此miRNAs特别是存在于体液和血液中的miRNAs，无论是作为流动的分子还是血管的一部分，作为潜在的疾病生物标记物受到了越来越多的关注。 NK细胞作为先天免疫细胞在抵抗病毒感染和检测肿瘤转化过程中发挥重要作用 NK细胞代表细胞毒性，固有免疫细胞和它们的主要功能是机体遭受感染、自体转化细胞和同种异体细胞攻击时迅速启动免疫反应，然而NK细胞并不需要抗原激活发挥功能，非自体识别的机制不依赖基因重排和细胞克隆扩增。目前，这些细胞也通过分泌细胞因子、干扰素g、细胞坏死因子TNF-a调节免疫监控机制，或者通过与免疫或适应性免疫细胞相互作用。反之，NK细胞也对其他免疫细胞产生的不同类型的趋化因子和细胞因子产生应答。NK细胞并不是一个同质性的群体，不同的NK细胞亚群细胞的表型、成熟程度和功能是不同的。成熟NK细胞被分为两个亚群：在淋巴器官中大量富集且能分泌促炎症因子的调节型NK细胞（CD56bright/CD16−）和约90%存在于体液中细胞毒性的NK细胞（CD56dim/CD16+）。无论是NK细胞的杀伤作用还是免疫调节功能都依赖于NK受体的激活或者抑制信号，通过识别保守的病原体结构降低NK细胞的活性。 在稳态条件下，NK细胞从抑制型NK细胞受体获取抑制信号并且一系列经典和非经典的HLA-Ⅰ分子在自体细胞表面表达。异源的或者病毒感染的或者肿瘤细胞与这些受体都是低表达的或者不表达，使得抑制型NK细胞受体不被自体细胞识别。在这种条件下，激活型的NK细胞受体与配体协同作用靶基因激发NK细胞杀死细胞。重要的是，在肿瘤细胞中仍然维持HLA-Ⅰ分子的表达，抑制型NK细胞受体作为免疫检测点，封闭了NK细胞的细胞毒性，已经有一些策略通过加强NK细胞的活性对抗HLA-Ⅰ分子表达的肿瘤细胞。例如基于IL-2的免疫治疗使NK细胞不理会AML的抑制信号，近年来，基于抑制型NK细胞受体的单克隆抗体开始用于免疫治疗特别是anti-pan-KIR2D和anti-NKG2A，这些抗原有效的破坏NK细胞免疫检测点和配体之间的相互作用，使NK细胞能够有效地杀死HLA+的肿瘤细胞。此外慢性感染和肿瘤的微环境可能改变NK细胞的表型减弱NK细胞的功能。最普遍的一个现象是激活型NK细胞受体表达的降低或伴随抑制型NK细胞受体表达升高。 事实上除了T淋巴细胞，NK细胞也可以表达PD-1。PD-1是人类巨细胞病毒血清阳性个体来源完全成熟的NK细胞。在不同肿瘤中PD-1+的NK细胞显著增多。许多研究都说明NK细胞在靶向PD-1/PD-L1的免疫治疗中发挥重要作用，在HLA-Ⅰ阴性的肿瘤患者中存在相关性。除了在黑色素瘤和肺癌等肿瘤中检测点抑制剂的广泛应用，无论在血液瘤还是实体瘤中封闭PD-1/PD-L1的抗原作为单一疗法还是与其他抗原结合被评估，包括在HLA-Ⅰ+肿瘤中的anti-pan-KIR2D和anti-NKG2A。 综上，NK细胞的活化依赖于表面激活/抑制型受体及其靶细胞上的相应配体。因此受体/配体结合作为重要的检测点能够调节抗肿瘤NK细胞的活性以及基于NK细胞的免疫治疗中。 miRNAs调节NK细胞的存活、发展/成熟和功能 许多研究表明miRNAs在正常生理或病理状态下通过靶向受体或其他因子的表达在调节NK细胞存活、发展/成熟、活化、增殖、细胞毒性和细胞因子生成中发挥重要作用。 miRNAs参与NK细胞的分化/发育 第一条关于miRNAs在免疫系统发挥重要作用的证据是Dicer在体内的招募。在不同血液种系小鼠中条件性敲除Dicer出现缺陷，例如细胞分化、增殖、存活减弱。2010年Bezman等人通过敲除Dicer/Dgcr8发现miRNA的功能，Dicer/Dgcr8缺失的NK细胞死亡率升高，这也提示miRNAs在控制细胞存活中扮演重要角色。此外，Dicer/Dgcr8缺失的NK细胞能够通过细胞因子受体有效地应答，然而包含ITAM的激活型NK细胞受体的功能受损。2012年Sullivan等人在小鼠骨髓NK细胞的最早阶段通过整体敲除成熟的mRNA更好的描述了表型特征。以上结果均说明miRNAs的敲除能够有效减少NK细胞的数量，体外增殖/存活明显降低。 研究者在细胞因子激活的人源CD56+ CD3−或者鼠源NK1.1+CD3−的NK细胞中利用二代测序分析了miRNA的整体。此外，确定了不同部位人源NK细胞的miRNA图谱，且近年来研究者所在的团队分析了10个健康捐血者的外周血NK细胞，确定了不依赖表型且能够区分CD56阳性或者阴性的108个miRNA特征。研究者也发现一些miRNA（miR-146a-5p、miR-92a-3p、miR-223-3p, miR-873-5p、miR-31a-5p、hsa-miR-130a-5p、miR-181a-2-3p）所在两个NK细胞亚型中明显不同。 对NK细胞发育重要的miRNA是miR-150。miR-150功能获得性实验证实其能驱动NK细胞的发育和成熟，在小鼠中敲除miR-150使NK细胞的成熟产生缺陷。在NK细胞的成熟中miR-181和miR-583起重要作用。Cichocki等人研究发现miR-181能够通过抑制NLK酶促进NK细胞的发育；Yun等人发现miR-583在NK细胞分化过程中负调控IL2Rγ。 miRNAs参与调节NK细胞的功能 越来越多的证据表明不同的miRNA根据细胞毒性或细胞因子的生成对NK细胞功能发挥不同的调节作用。miR-27a-5p，miR-378，miR-30e以及miR-150对NK细胞的杀伤起负调控作用。miR-378靶向Gzmb，miR-30e和miR-150能够靶向Prf1，miR-27a-5p能够靶向两者，miR-362-5p过表达能够引起NK细胞中Prf1、Gzmb、IFN-γ以及CD107a的上调。Ni等人的研究也提示miR-362-5p能够促进NK细胞效应器的功能。miR-155对NK细胞功能的表达也有报道，IL-2、IL-15以及IL-21能够正调控miRNA，提高NK细胞的细胞毒性。此外miR-155能够引起NK细胞广泛的激活，通过调节NK细胞活化的相关分子或者磷酸化SHIP-1、T-bet/Tim-3的表达释放IFN-γ，或者激活PI3K、NF-kB，和钙调磷酸酶相关的信号通路。同样，miR-181在Notch信号通路中能够在NK细胞应答细胞因子刺激时促进IFN-γ的表达。在一项探究miRNAs在慢性疲劳综合征和肌痛性脑脊髓炎中作用的研究中发现外周血单核细胞中有34个不同于健康对照组的miRNAs且有两个miR-99b和mi-R-330-3p依据细胞毒性确定对NK细胞起负调控作用。 NK细胞中病原体调控的miRNAs 受到病原体攻击时机体的免疫应答受到信号的复杂调控。病原体能够攻破这一平衡的机制之一是干扰miRNA的调节作用。先天性免疫系统受体TLRs能够直接识别NK细胞表面病毒或细菌来源的保守结构，已经报道miR-21，miR-146，miR-155和let-7家族成员与TLRs结合受体或者相应的蛋白结合，在调节TLRs表达和转录中发挥作用。也有报道miRNA和包含miRNA的外泌体能够通过TLR1-NF-kB信号通路激活先天性免疫效应细胞。肝癌患者中miR-182过表达使伴随Prf1上调的NK细胞毒性升高，但是HCV中的结果相反。Komabayashi等人报道miR-15a抑制细胞增殖，Cheng等人也发现负调控miR-155能够通过Tim-3信号通路抑制IFN-γ的产生，使HCV能够躲避免疫系统的清除，但是miR-155的靶基因尚不明确。miR-155通过STAT4由IL-2和IL-18产生，能够在内稳态和活化两个阶段降低NOXA和SOCS1的表达。在小鼠的NK细胞中靶向敲除miR-155，在感染MCMV后发现效应器的活性减小且记忆细胞的数量降低，这一结果提示miR-155能够提高抗病毒的免疫力。然而Eleman等人却发现HCV感染后过表达miR-29a-5p和miR-155能够消除NK细胞的细胞毒性。 肿瘤相关NK细胞中的miRNAs 在人类不同的组织表型中miRNAs可能直接扮演促癌因子或者抑癌因子的角色。在肿瘤微环境中大多数miRNAs被定义成具有调节NK细胞抗肿瘤活性的功能。在TME中肿瘤细胞释放的TGFβ是NK细胞杀死活性的抑制剂。Donatelli等人的研究发现miR183是TGFβ产生的，首次提出miRNA能够负调控DAP12的表达，DAP12缺失在肺癌中普遍存在。同时有报道称TGFβ能够提高miR-1245的翻译后水平，miR-1245能够抑制NKG2D的表达，因此破坏NKG2D调节的免疫反应。Yang等人的研究称miR-218-5p能够通过靶向SHMT1抑制NK细胞介导的非癌的杀死作用。一些研究发现miRNAs能够通过PTEN-AKT-mTOR等信号通路影响NK细胞淋巴瘤的存活和凋亡，例如miR-203，miR-494-3p，miR-142-3p，miR-155，miR-21等。 近期的研究也表明miRNAs作为肿瘤抑制因子发挥作用，例如miR-150能够促进凋亡抑制肿瘤细胞的增殖，参与淋巴瘤的病理形成。利用NK/T淋巴瘤模型发现miR-26a，miR-26b，miR-28-5，miR-30b，miR-101, andmiR-363可能受到MYC负调控从而提高肿瘤发生相关基因的表达。Huang等人的研究发现miR-10a和miR-342-3p通过TIAM1信号通路参与NKTL的发展。miR-221和miR-155等促进NKTL的生存，已经被认为是NKTL的分子标记物。越来越多的证据表明NK细胞释放的EVs能够转运miRNAs，从而表现出很强的抗肿瘤活性。之前的研究表明NK细胞来源的外泌体能够特异性的富集肿瘤而非正常组织且不表现出细胞毒性。肿瘤微环境中的酸性pH能够促进EVs富集。因此NK细胞来源的外泌体不仅能够促进肿瘤的靶向而且表现作为抗肿瘤抗原，这些特性都说明它们适用于临床应用，提示肿瘤治疗中NK细胞来源的EVs可作为抗肿瘤抗原。 miRNAs参与NK细胞免疫检测点的调节 免疫检测点的抑制作用可以调节免疫应答的强度。免疫治疗中免疫检测点抑制剂的应用具有抗肿瘤的水平。越来越多的证据表明一些miRNAs能够在NK细胞的表面调控免疫检测点的表达或者肿瘤细胞内配体的表达。这也提示miRNAs在抗肿瘤治疗中的作用。在近期的研究中研究者发现miR-146a-5p能够负调控KIR家族中两个HLA特异性的抑制型受体KIR2DL1和KIR2DL2（图1A）。此外经电脑模拟确定miR-146a-5p的靶基因是CD94，HLA-C，HLA-E，Prf1以及一些其他的KIRs，这一结论与CD56bright的NK细胞中miR-146a-5p高表达一致，其他的研究也表明miRNA通过STAT1和NFkB信号通路调节NK细胞的成熟。有研究小组发现3个miRNA：miR-26a-5p、miR-26b-5p和miR-185-5p是KIR3DL3表达的抑制剂，KIR3DL3属于抑制型NK细胞受体，但具体作用机制尚不明确（图1A）。因此，miRNAs在NK细胞成熟过程以及功能调节中的角色有待进一步确定。Abdelrahman等人研究发现在肝癌中受NKG2D和NKG2A复合体的调节miR-182能够提高NK细胞的毒性、提高Prf1的表达（图1B）。 考虑到miRNAs能够调节PD-1的表达，研究者发现miR-28、miR138、miR-4717能够靶向免疫检测点，产生T细胞耗竭。miR-4717在HBV感染中减少。由于NK细胞也能表达PD-1，并不能排除这些miRNAs在这些固有细胞中发挥调节作用。重要的是，一些miRNAs你能够靶向细胞毒性相关的免疫检测点，例如miR-28能够靶向TIM-3，miR-16、miR-138和miR-195能够靶向CTLA-4的表达。 miRNAs参与调节NK细胞受体相应配体的表达 肿瘤细胞的免疫逃逸不仅不受免疫检测点蛋白上调的影响，也不受配体表达的影响，包括经典的或者非经典的HLA-1分子或者活化NK细胞的配体。有报道称miR-9能够负调控HLA-1分子阻止免疫系统检测到肿瘤细胞（图1C）。过表达miRNA的肿瘤对CD8+T细胞调节的杀死作用起抵抗作用但是易受NK细胞的攻击。的确具有肿瘤抑制作用的miR-148被发现能够调节HLA-G（不同NK细胞抑制型受体的配体）的表达（图1D）。有报道称miRNAs能直接靶向PD-L1mRNA的3端UTR或者相关的信号通路。在恶性胸膜间皮瘤中miR-15a，miR-15b以及miR-16能够负调控PD-L1的表达；在44型AML中miR-34a与PD-L1的表达密切相关；在乳腺癌的不同组化中miR-935p，miR-106b-5p，miR-138-5p，miR-142-5p，miR-193a-3p，miR-200，miR-570的过表达能够负调控PD-L1的表达；在胃癌中miR-152也发现能够调节PD-L1的表达；在卵巢癌耐药的患者中miR-424能够调节PD-L1的表达（图1D）。在乳腺癌中miR-873能够通过直接抑制PD-L1的表达，负调控PI3K/Akt和ERK1/2信号通路减低干性和化疗的耐药性，miR-873和PD-L1的调节展现了乳腺癌新的治疗靶向。以上证据均说明在PD-1/PD-L1阻塞的治疗中miRNAs是有效的治疗靶向和诊断的生物标记物。促炎症反应中的成员miR-155在多种癌症中调节异常，有报道称在原代淋巴管内皮细胞和成纤维细胞中miR-155通过使细胞暴露在TNF-α和IFN-γ促炎症因子下能够抑制PD-L1的表达。 此外不同的miRNAs能够靶向NK细胞毒性负调控MICA/B的表达，进而抑制免疫反应。miR-183、miR-20a以及miR-25/93/106b家族、miR-20a、miR-93、miR-106b分别在肺癌、卵巢癌以及HCC中有报道。 结论 癌症的免疫治疗表现出新的前景。过去的研究主要是miRNAs参与表观遗传调控及其直接调节参与激活/抑制的免疫反应基因表达，进而调节肿瘤免疫性的能力。在本研究中作者聚焦miRNA参与NK细胞成熟的多个过程，讨论了它们对NK细胞免疫反应的调节以及在肿瘤免疫治疗中耐药性发挥的重要作用。一些miRNAs能够调节不同的免疫检测点/配体的相互作用，包括PD-1/PD-L1或者上游基因。在接下来的研究中通过比较应答免疫检测点封闭的免疫治疗患者及其对照组所展现的miRNAs表达，将会进一步挖掘miRNAs作为生物标记物，检测免疫治疗的重要作用。 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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