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编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 衰老是一个高度复杂的生物学过程，通常伴随着组织功能的普遍下降，以及与衰老相关疾病的风险增加，如心血管疾病、中风、癌症和神经退行性疾病。事实上，随着平均寿命的不断增加，与衰老相关的功能衰退，如认知障碍，将可能成为以后在医疗保健中需要优先考虑的事项。例如，最常见的痴呆形式是阿尔茨海默病（AD），但在老年人群中很大一部分的认知障碍不是AD，而是正常的衰老过程。因此，确定在衰老过程中保持机体功能完整性的方法是非常重要的。人们已经提出了许多理论来解释我们为什么变老。最近，研究者提出了一种新的理论猜想，认为衰老是人体微循环持续受损的过程。事实上，有可靠的证据表明血液中的系统性因素可以极大地逆转衰老相关的损伤，它们受到特定的使更年轻或变衰老的因子的影响，例如蛋白质、microRNAs（miRNAs）和mRNAs。因此，许多循环因子被鉴定为组织特异性疾病和衰老的有吸引力的生物标志物。然而，血液衍生因子对衰老的作用机制仍不清楚。 过去二十年的研究表明，细胞主要通过释放细胞外囊泡（EV）进行通讯，这些囊泡可以作用于附近的细胞（旁分泌信号）或最终进入循环体液，并可能在远处产生影响（内分泌信号）。外泌体是小的EV（直径约50-150nm），主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体。事实上，外泌体包含许多特定的蛋白质，mRNAs，miRNAs和长非编码RNAs，并通过在源细胞和靶细胞之间转运其货物的方式在细胞通讯中发挥重要作用，这在衰老和与衰老相关的疾病中也很重要。例如，将年轻小鼠的血清外泌体注射到年老小鼠体内可以改变衰老相关分子的表达模式，以模仿年轻小鼠的表达模式。此外，研究表明，脑细胞外泌体可以跨越血脑屏障（BBB），作为AD认知障碍的外周循环生物标志物，而且，血液外体也可以穿过血脑屏障，靶向脑细胞并影响脑功能。因此，外周循环外泌体具有诊断和治疗的潜力。然而，大多数的研究都集中在建立比较疾病状态和相对应的健康状态的外泌体蛋白或miRNA图谱上，很少有研究关注正常衰老过程中外周循环外泌体中蛋白质和miRNAs的特征。因此，明白能从外泌体转移到受体细胞的外泌体蛋白和miRNAs的分布是非常重要的。重要的是，据有关估计miRNAs通过促进其mRNAs的降解或抑制其翻译来调节约31%的真核基因。事实上，miRNA可以调节新陈代谢、免疫、寿命、细胞增殖、凋亡和发育，以及病理过程，如癌症、心血管和神经退行性疾病。因此，在转移到受体细胞的外体货物中，miRNAs可能对细胞功能的下游影响最大。为了探讨循环外泌体在衰老过程中的作用，外泌体miRNAs必须有更广泛的表征。此外，最近的证据表明许多信号通路调节正常的衰老过程。然而，关于衰老如何影响外泌体miRNAs和mRNAs的共表达谱，以及miRNA调控网络对衰老过程的系统影响的研究还很缺乏。 为了解决人们对外泌体miRNA功能认识上的不足，研究者使用高通量测序技术建立了年幼的和年老的老鼠来源的循环外泌体的miRNA和mRNA表达谱。此外，研究者还利用生物信息学工具，包括GO分析、KEGG分析、KOG功能分类和IPA分析等，分析了miRNA靶点的生物学重要性和与衰老相关的主要信号通路，通过这些研究去深入探究了外泌体miRNA可能存在的作用。研究者的发现可能为理解与衰老相关的循环miRNAs组成变化的生理后果提供基础资料，并可能引起对衰老相关的疾病的潜在干预。 论文ID 原名：Peripheral Circulating Exosomal miRNAs Potentially Contribute to the Regulation of Molecular Signaling Networks in Aging 译名：外周循环外泌体miRNA可能有助于分子信号网络在衰老过程中的调控 期刊：International Journal of Molecular Sciences IF：4.2 发表时间：2020年3月11日 通讯作者：Hongxia Zhang & Kunlin Jin 作者单位：美国北德克萨斯大学沃思堡健康科学中心 结果 血清外泌体的特征描述 研究者首先用Western blotting法测定了年幼和年老的大鼠血清外泌体中的蛋白质含量。结果显示：血清外泌体标志蛋白CD63和CD9在年幼和年老的大鼠中都成阳性。NTA分析证实外泌体粒径范围在40-120nm，平均值为82±0.8nm，这是之前研究报道的外泌体粒径在70-120nm处达到峰值的报道是一致的。此外，用透射电镜(TEM)证实了纯化后的颗粒具有膜结合，在尺寸上是圆形和非均质的(40~120nm)。 Fig1：血清外泌体的特征描述 和年龄相关的血清外泌体RNA的差异表达 为了确定衰老是否影响血清外泌体RNA的表达水平，采用高通量RNA测序技术测定了RNA的表达谱。经过质量控制和去除冗余，共有35117个RNA，包括mRNA、miRNAs和其它类型的RNA，从年幼的和年老的大鼠血清外泌体中鉴定出来。在采用显著性分析后，在被鉴定的15272个mRNA中，来自年老的大鼠的血清外泌体共有2736个下调，占总数的17.9%，有108个上调，占总数的7%。此外，在质量控制后，有600个miRNA被鉴定出来，其中68个在年老的大鼠中含量丰富，在这68个miRNA中，来自年老的大鼠的血清外泌体的有20个miRNA下调，48个miRNA上调。火山图和聚类分析揭示了在利用targetscan网站分析后的和衰老相关的血清外泌体差异表达的mRNAs和miRNAs的整体分布情况。 Fig2：年幼的和年老的大鼠血清外泌体mRNA和miRNA的表达图谱 miRNA靶向的mRNA鉴定 miRNA调节特定基因的表达通过结合mRNA进而促进它们的降解来抑制翻译，或者两种作用都存在。火山图显示了在这项研究中研究者鉴定的外泌体miRNAs的总体分布（图3A）。为了研究差异表达的miRNAs可能的功能作用，用Targetscan分析了它们潜在的mRNA靶点。在68个miRNA中，只有19个与和年龄相关的差异表达的2844个mRNA中的766个mRNA有关，提示这些miRNAs可能参与了特异性mRNAs的年龄依赖性调控。其中相对于年幼的大鼠，在年老的大鼠血清外泌体中有5个mRNA表达下调，14个mRNA表达上调。在miRNA方面，miRNA-483-3p和miRNA-489-3p只在年幼的大鼠外泌体中检测到，而miRNA-187-3p、miRNA-202-3p、miRNA-450b-5p、miRNA-501-3p、miRNA-511-5p和miRNA-598-3p只在年老的大鼠外泌体中检测到。图3D展示了每一个样品差异表达的miRNA的聚类分析的结果。 Fig3：年幼的和年老的大鼠血清外泌体中差异表达的miRNA图谱 mIRNA靶向mRNA的GO富集分析 为了更好地了解这些外泌体miRNAs在衰老中的潜在作用，研究者使用Blastp对GO富集分析中确定的靶基因进行功能注释和富集分析。功能注释按生物过程、细胞成分和分子功能进行分类，仅考虑p值最小的前10个GO项。这些代表了对靶基因功能丰富的注释，较低的p值代表了相对项的有更大的功能丰富度。值得注意的是，这些GO项下面的几乎所有基因在年老的大鼠血清外泌体中都被下调。这项分析揭示了几个丰富的功能分类和靶基因，包括参与蛋白质翻译后修饰、代谢过程、细胞通讯、分子功能与细胞内信号转导的基因。 Fig4：在年幼的和年老的大鼠间19个差异表达的miRNA调节的靶基因的GO分析、KOG功能分类和KEGG通路分析 KOG和KEGG富集分析 用KOG对在年幼的和年老的大鼠之间存在差异表达的19个miRNAs调控的mRNAs（共有766个mRNA）进行功能分类。在由此产生的25个KOG分类中，参与“信号转导机制”的基因是最常见的靶向基因（有151个基因），其次是“一般功能预测”（有119个基因）、“转录”（有56个基因）、“翻译后修饰和蛋白质转换”（有55个基因）和“细胞内功能和分泌及囊泡转运”（有40个基因）。 KEGG是一个功能注释和基因组信息实际应用的综合性知识库。KEGG路径分析确定了在年幼的和年老的大鼠外泌体之间存在差异显著的20条信号途径。在这些途径中，发现以下与衰老和寿命有关：胰岛素抵抗，MAPK信号通路，PI3K-Akt信号通路，mTOR信号通路，toll样受体信号通路，FoxO信号通路，ErbB信号通路，寿命调节信号通路，EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抵抗通路。 Fig5：来自年幼的和年老的大鼠血清外泌体差异表达的miRNA的IPA分析 Fig6：差异表达的外泌体miRNA调节的最常见的靶基因和mTOR信号通路 通路和相互作用网络分析 然后研究者对在衰老期间与血清外泌体miRNAs相关的分子途径进行了IPA软件分析。结果表明，163个IPA典型途径与血清外泌体miRNAs的表达显著相关（p<0.05）。图5A显示了miRNAs靶向的与衰老相关的前22个最强的途径。研究发现的与衰老相关的信号通路包括胰岛素、整合素、ErbB、神经调节蛋白、mTOR、阿片类、端粒酶、PTEN、IGF-1、AMPK、生长激素、eNOS、一氧化氮、FGF、cAMP、鞘氨醇、PDGF、DHA、TREM1和p53，提示miRNAs能够靶向调节衰老的多种生物途径。 Tab1：和年龄相关的差异表达的循环miRNA列表 Tab2：和年龄相关的差异表达的19个miRNA靶向基因的IPA分析 图5B显示了IPA分析网络的结果，表2列出了miRNAs参与的9种途径。与IPA的结果类似，这些作用网络包含的基因被预测与新陈代谢、生长激素信号和氧化应激有关。如图5B所示，每个途径都与多个基因转录本相连，单个基因可由多个miRNAs调节。这表明血清外泌体miRNAs调节通路间的crosstalk在年幼的和年老的大鼠中不同。网络中最常见的蛋白是EIF4EBP1、INSR、PDPK1、PTEN、PXN和IGF-1R，它们被最重要的miRNAs靶向（图6A）。整体来说，本研究的结果建立了miRNAs和它们的靶向mRNA，分子作用网络和调节年幼的和年老的动物血清外泌体miRNAs组成相关的生物途径之间可能存在的作用。图6B展示了miRNA介导的调控的这样的一个例子。 讨论 在过去的二十年中，人们使用了异种血液交换技术，包括异种共生、异种血液或血浆移植，异种血浆分离，作为研究衰老生物学的工具。事实上，从年幼的动物到年老的动物的异种血液交换导致了年轻化，而在一只年幼的动物中，用一只年老动物的异种血液交换后，观察到年幼动物会加速衰老。为了探讨其作用机制，研究者用Exo-NGS技术分析比较了年幼和年老大鼠血清外泌体中mRNAs和miRNAs的表达谱。研究者在年幼和年老大鼠的血清外泌体中鉴定出68个miRNA和2844个mRNA。与mRNAs相比，人们对miRNA在衰老过程中的丰度变化知之甚少。因此，研究者将重点放在循环miRNAs上，它可以作为衰老相关疾病的潜在生物标记物和治疗靶点。为了确定这些循环miRNA是如何影响衰老的，鉴定每个miRNA的靶点是很重要的。本研究的数据显示，在鉴定的68个差异表达的血清外泌体miRNA中，基于TargetScan分析，有19个被预测为靶向766个差异表达的mRNA，在19个miRNAs中，年老大鼠外泌体中有14个比年幼大鼠丰富，有5个不太丰富。这些结果与报道的14个miRNAs中大多数的丰度一致，包括miR-150-3p、miR-378-3p、miR-199a-5p、miR-145-5p、miR-598-3p、miR-122-5p、miR-194-5p、miR-203a-3p、miR-202-3p、miR-145-5p和miR-532-5p，这些都在年老的人、小鼠和大鼠的血液或组织样本中表达上调。本研究的数据也证实了miR-181a-5p和miR-133a-3p随年龄增长而降低。这14个与衰老有关的miRNA，其中一些miRNA的表达与癌症、长寿、炎症反应以及与衰老相关的神经退行性疾病和心脏病有关。总的来说，大多数差异表达的miRNAs的丰度先前已经被报道随着年龄的增长而改变，这表明这些miRNAs在寿命中可能会发挥作用。有趣的是，在年老大鼠血清外泌体中miR-181a-5p的下调与促炎细胞因子IL-6和TNF-α表达呈负相关，在恒河猴血清中与抗炎细胞因子TGFβ和IL-10呈正相关。尤其是，IL-6和TNF-α的丰度与衰老相关。因此，某些外泌体miRNAs可能通过调节全身炎症而导致衰老，这些miRNAs的组成可能是衰老的生物学特征。 研究者使用Blastp和GO对miRNA调控基因进行功能注释，并确定了随着年龄的增长，外泌体miRNA丰度变化而改变的生物学过程。在这些过程中，最具代表性和最丰富的是蛋白质翻译后修饰、代谢过程、细胞通讯、分子功能和细胞内信号转导，这意味着这些miRNAs可能通过调节靶基因在衰老和多种生物学过程之间提供了重要的联系。KEGG通路分析显示，这些miRNA靶向的mRNAs富含已知的与衰老相关的信号通路。GO和KEGG分析还显示，大多数miRNA靶向的mRNA都参与了对衰老至关重要的信号通路和生物过程，这表明循环miRNAs可能有助于调节衰老的速率，因此可能是潜在的衰老生物标志物。任何单个miRNA都有可能作用于许多靶基因，因此，多个miRNA有可能调节许多生物途径。因此，通过检测miRNAs之间的协同作用，可以最有效地评估miRNAs对任何特定途径的影响。为了进一步研究单个miRNA-mRNA的相互作用是如何调节衰老相关的通路的，研究者进行了IPA软件分析，发现表达变化的循环miRNA靶向于胰岛素、整合素、mTOR、AMPK、PTEN、IGF-1、生长激素、eNOS和p53调控的信号通路，这是衰老和寿命的关键途径。例如，研究者发现miRNA-187-3p可以调节INSR的mRNA，miRNA-378a-3p和miRNA-202-3p可以调节IGF-1R mRNA。研究表明miRNA-187水平与葡萄糖刺激的胰岛素分泌呈负相关，miRNA-378a可能在胰岛素抵抗和肥胖中起作用。胰岛素/IGF-1途径在许多物种的衰老和寿命中起着关键作用。有证据表明，降低循环IGF-1水平或降低IGF-1R的表达可延长小鼠的寿命； 此外，IGF-1受体一个等位基因的缺失可使小鼠的寿命延长33%。研究者还发现miR-187-3p、miR-202-3p和miR-378a-3p调节INSR、EIF4EBP1和PDK1的mRNA水平，其基因被mTOR信号通路靶向。mTOR通路整合了细胞内和细胞外信号，是细胞代谢、增殖和存活的中枢调节器，通过激活p70S6K和抑制翻译抑制因子eIF4EBP调节翻译来控制寿命。例如，敲除三个翻译调控因子，即eIF4E、eIF4G和eIF2B同源物，延长了秀丽隐杆线虫的寿命，以及通过一种显性负性的TOR方式调节它们的mRNA翻译来延长寿命。最近的研究表明：雷帕霉素mTOR抑制剂能显著延长不同品系小鼠的寿命。通过mTOR或胰岛素/IGF-1的信号传导减少对寿命的影响还没有明确的解释。然而，一个可能的解释是在抑制了这些信号通路中任何1个之后，机体的mRNA翻译减少，这样它可以减少与蛋白质折叠、修复和降解相关的负担和能量需求，从而保持更好的机体蛋白质内稳态。目前研究者的发现支持这个假设。 除了胰岛素/IGF-1和mTOR途径外，许多其他信号途径，如PTEN途径，也调节寿命。事实上，PTEN通过其抗氧化活性和对热量的限制，以及参与DNA损伤减少、DNA复制抑制和肿瘤抑制，对延长人类寿命具有重要意义。本研究发现miR-203b-3p可以靶向PTEN。 值得注意的是，诸如胰岛素/IGF-1、mTOR和PTEN等信号通路可能单独调节衰老和寿命。然而，这些信号网络不是自主的，而是通过一些特定的媒介连接起来的。例如，mTOR有两个复合物mTORC1和mTORC2，mTORC1受Akt调节，mTORC2是Akt激活剂。PI3激酶信号激活mTORC2，mTORC2又激活许多其他激酶，包括PKCα。一贯地，研究者发现，EIF4EBP1、INSR、PDPK1、PTEN、PXN和IGF1R存在重合的作用并受至少两个循环miRNAs调节，并且这些通路中的每一个途径在衰老过程中都可能发挥独特的作用。 综上所述，本研究的发现表明，随着年龄的增长，循环外泌体miRNAs的组成变化不仅可以被认为是动物年龄的一个潜在预测因素，而且可能有助于通过调节衰老和寿命的几个关键信号途径来影响衰老。识别和理解年轻化和加速衰老的机制很重要，因为有关年轻化的发现可能逆转衰老的发生过程，而有关加速衰老的发现可能为相关的干预措施，指明可能减缓衰老速率和衰老相关疾病发生率的潜在途径。未来的挑战将是确定这些因子如何映射到不同的途径上并相互作用，以及如何解释它们在衰老的分子机制中的作用。 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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