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编译：小北，编辑：十九、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 论文ID 原名：A Roadmap for Fixing the Heart: RNA Regulatory Networks in Cardiac Disease 译名：修复心脏的路线图___心脏疾病的RNA调控网络 期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids 影响因子：5.9 发表时间：2020年4月25日 作者：黄展鹏 单位：中山大学第一附属医院、中国香港大学 DOI：10.1016/j.omtn.2020.04.007. 背景介绍 心脏疾病是世界范围导致死亡的主要因素，受外界压力或者刺激下，心脏通过不同的重塑维持内稳态。在重塑的起始机体会改变企图弥补异常。在心脏重塑过程中补偿机制逐步失调。这一改变将导致心脏收缩异常，最终导致心力衰竭。当心脏面临严重的病理改变，如胶原蛋白的产生、非收缩性瘢痕组织、心肌壁变薄、心室进行性扩大和扩张，病人将有一个较差的预后同时提高死亡率。尽管在包括心力衰竭等心肌疾病治疗方面已经取得重要进展，仍然缺乏改变疾病率和死亡率的治疗选择。新的治疗靶向的发现急需发展成为治疗心脏疾病的有效手段。 大多数的研究聚焦参与心肌疾病发生发展的编码基因。然而在哺乳动物基因组中绝大多数转录激活的是非编码蛋白（75%–90%），只有一小部分DNA编码的蛋白（2%）。因此，探究RNA调控网络是必须的，越来越多的证据也提示非编码RNA（ncRNAs）参与调控蛋白编码基因的表达。ncRNAs包括有功能的RNA、几乎所有的ncRNAs、microRNAs (miRNAs)、long ncRNAs (lncRNAs)、circular RNAs (circRNAs)备受 生理学和病理生理学方面研究的关注，包括心血管生物学和疾病。近期也发现之前发现的错标的ncRNAs能够通过sORFs编码稳定的功能肽段，并且这些从sORFs产生的微小肽段参与调控心脏的生理功能。大多数的RNAs都经历转录后修饰，有超过100个RNA分子修饰包括mRNA的剪接、成核、稳定和翻译进而调节基因表达。其中N6-甲基腺嘌呤(m6A)是RNA修饰中与人类疾病紧密联系的一种。尽管对于m6A RNA修饰的研究都关注在肿瘤的生物学，近期的研究也显示m6A修饰参与心脏疾病。 在本综述中，研究者系统总结了近期在心脏疾病中ncRNA和RNA修饰包括心肌重塑、纤维化以及再生。同时讨论了在心肌疾病中诊断和治疗应用的发展与挑战。 主要内容 ncRNAs在心脏疾病中扮演重要角色 miRNAs在心脏疾病中进行基因表达的转录后调节 miRNAs是长度为20-22个nt的小的单链ncRNAs，通过导向它们的靶mRNAs到RISC沉默复合体调节基因的转录后表达。线虫中的lin-4是20世纪90年代初期第一个被诠释的miRNA。该分子抑制靶基因的表达调节蠕虫幼虫的发育时间。随后的研究报道人类基因组中约1/3的基因受miRNAs调节，这也提示miRNA在一系列生物学过程中发挥重要作用。大量的数据表明miRNA参与每个生物学过程，包括增殖、分化、凋亡以及肿瘤的发生发展。越来越多的证据也提示miRNAs与心肌的生理和病理密切相关（表1）。 表1 miRNA调节与心肌功能列表 心肌富集的miRNAs 因此，这些在心肌富集的miRNAs可作为心肌细胞的门卫，维持心肌细胞的生理机能，包括收缩装置的组装和功能、控制电生理学的功能，确保血液泵血循环的有效性和协调性。 广泛表达的miRNAs 除了心肌富集的miRNAs，一些广泛表达的miRNAs在心脏病理学中扮演重要角色。之前的研究指出miR-21参与多个心脏异常的病理过程，包括错配、心律不齐、心力衰竭、梗塞。Thum等人发现miR-21能够通过抑制Spry1的表达活化ERK/ MAPK信号通路，进而促进心脏成纤维细胞活化和生长因子分泌。有趣的是，antagomiR-21的静脉注射能够抑制心肌纤维化并且保存心肌的功能。然而，准确的机制依然不明确。这也提示成纤维细胞外染色体衍生的miR-21_3p(miR-21*)是一个潜在的旁分泌RNA分子能够诱导心肌肥大。近期的研究表明miR-21通过靶向TGF-b1/Smad7信号通路在心肌成纤维细胞活化和MI后的心肌纤维化中扮演重要角色。有趣的是Smad2和Smad3的磷酸化作为TGF-b信号通路下游的效应因子，压力负荷下通过反馈回路与DROSHA相互作用促进miR-21的加工。Zhou等人也表示miR-21能够促进心肌成纤维细胞的增殖，通过靶向Jagged1促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，同时说明通过基因剪接使miR-21缺失并不与antagomiR干扰所导致的心肌表型一致，这也提示miR-21功能的短暂干扰可能通过其他机制进行弥补。 MiR-21也参与调节缺血性心肌病中心肌细胞的凋亡。AMI后梗死区域6小时miR-21下调。此外的研究发现miR-21通过PDCD4/AP-1信号通路靶向PDCD4抑制缺氧诱导的凋亡。因此miR-21降低由于缺血-再灌注(I/R)损伤导致的心肌细胞氧化应激，发挥保护作用。 MiR-15家族包含六个成员都具有相同的种子序列，包括miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-195以及miR-497。近期一些研究也表明miR-15家族在心肌疾病的发病机理中扮演重要角色。Tijsen等人发现miR-15家族成员在肥厚性心脏中上调。利用LNA基础上的antimiRs抑制miR-15b导致心肌肥大过程中心脏的重量显著升高、过度纤维化并且胶原沉积。MiR-15家族能够抑制经典的和非经典的TGFb信号通路，在心肌纤维化和心肌肥大中组成了重要的信号通路，通过靶向多个直接的和间接的基因，包括TGFbR1、P38、SMAD3、SMAD7、血管内皮素等发挥作用。之前的报道指出miR-195在肥大生长和心脏内室重塑中发挥重要作用。更指出miR-195在肥大的心肌细胞中表达升高阻碍了LKB1/STRAD/MO25复合体的形成，通过抑制MO25激活AMPK信号通路。 总之，miRNAs仍需大力探索。在表1中参与心肌生理和病理过程中的miRNAs并未详细描述。 LncRNAs在调节心脏疾病中具有许多生物学功能 基因组大规模平行测序新技术使研究者发现了哺乳动物基因组中大量的区域能够转录成RNA。惊奇的是所有蛋白编码的序列仅来自大约人类基因组序列的1.5%。结果，许多非编码的转录本已经被确定。隶属于ncRNAs的lncRNAs长度大于200nt。越来越多的研究证实lncRNA在调节心血管生物学功能中发挥重要作用。研究者系统罗列了在心肌重塑中具有重要功能的lncRNAs，包括参与心肌肥大、凋亡、坏死和纤维化（表2）。 心肌肥大是心脏面临过量负荷的适应性反应，然后持续的肥大通常导致心力衰竭。近期研究起源于MYH7位点，在成人心脏中富集的lncRNA Mhrt通过与Brg1相互作用、抑制Brg1的功能，保护心脏免受病理性肥大。Brg1是一个染色质重塑的调节因子，在压力刺激下活化并引起心肌细胞的异常表达。相反的，lncRNA Chaer心肌肥大必需的因子，Chaer与PRC2相互作用干扰PRC2在基因组位点的靶向，这将抑制促肥大基因启动子区域依赖PRC2的H3K27me3，促进基因转录。LncRNA调节心肌肥大的分子机制并不局限于表观调控因子，还可以内源捕获miRNAs。例如lncRNA Chrf作为一个竞争性的RNA通过分离miR-489，使miR的靶向MYD88去抑制。此外，ROR、H19、Plscr4、(MIAT)75能够通过相似的机制抑制不同的miRNAs调节心肌肥大。 在心脏疾病中APF、CAIF、MALAT1能够调节心肌细胞的凋亡和自噬。在病理条件下APF的上调能够通过miR-188-3p去抑制ATG7，这将导致自噬异常和细胞死亡。相反，lncRNA CAIF作为心脏保护的调节因子，能够通过直接靶向启动子区抑制p53诱导的心肌细胞转录，这将在MI过程中抑制心脏自噬从而保护心脏。在I/R损伤中，MALAT1在心脏中高表达，通过分离miR-203引起更严重的心肌炎症和凋亡。 除了心肌细胞炎症和凋亡，lncRNAs同样能够调节心律不齐和纤维化。在心肌细胞中MALAT1通过调节miR-200c-HMGB1轴线的表达调节电生理活性。MALAT1敲除后通过HMGB1调节的瞬时外向钾电流和Kv4.2/Kv4.3通道蛋白的表达，同时能够抑制AngII引起的成纤维细胞增殖和胶原合成，进而通过miR-145抑制TGF-b1的活性抑制心肌纤维化。此外，Wisper、MEG3、GAS5也有报道通过许多分子机制参与心肌纤维化的调节。 如上述所提到的，lncRNAs在压力刺激下的心肌重塑发挥重要作用。重要的是包括Bvht、Fendrr在内的lncRNAs在心肌谱系中发挥作用并且这些lncRNAs缺失将导致发育缺陷。这些lncRNAs通过与PRC2复合体相互作用表观调控心肌细胞的转录。 circRNAs在心脏疾病中吸收miRNA circRNAs是一组ncRNA共价结合成环。之前的报道指出circRNAs在调节基因表达方面发挥重要作用，具有吸收miRNA的作用、转录以及转录后基因表达调节、选择性剪切和蛋白编码和蛋白圈套的活性。其中的一些分子以组织特异性的方式表达。近期的研究发现circRNAs与多个心脏疾病的生理和病理过程密切相关，例如冠状动脉疾病、心肌纤维化、心肌肥大以及心力衰竭。CircRNAs在心肌肥大和心力衰竭中发挥作用的最早报道显示circRNA HRCR表达下调，circRNA HRCR如海绵一样可分离心肌miR-223，体内过表达实验发现HRCR过表达能够引起miR-223的下游靶基因ACR表达升高。ACR在心肌肥大和凋亡中扮演重要角色，保护心脏。另一个有趣的研究发现circRNA Foxo3的表达在年老心脏中显著高于年轻人心脏。这将通过与抗衰老蛋白ID1和E2F1，抗压蛋白FAK和HIF-1a相互作用引起细胞衰老和阿霉素引起的细胞凋亡。这些相互作用封闭了细胞核内转换，抑制了他们作为转录因子的功能。 越来越多的证据表明circRNAs参与调节心肌再生。超级增强子区域的circRNA circNfix在成人心脏中促进表达。circNfix通过不同的分子机制调节心肌细胞的增殖。作为miRNA的海绵circNfix能够通过分离miR-214调节Gsk3b通路的活性。circNfix 与Ybx1、Nedd4l相互作用，通过泛素化降解Ybx1。敲除circNfix将促进心肌细胞的增殖和血管生成。因而减弱心脏的异常保护心脏。 除了作为RNA转录本发挥的作用，最贱的研究发现核糖体相关的circRNAs能够产生可检测的肽段，这些肽段在心脏疾病中的作用尚不明确，这将为未来的探索指明新的方向。 在心脏疾病中由非编码RNA编码的微小肽段 微小肽段是一组少于100-150个氨基酸长度的蛋白分子，与具有活性的肽段不同微小肽段起源于sORFs，位于lncRNAs和TUFs转录本；具有活性的肽段由更大的前体蛋白缠身，包含N端的信号序列。由于长度较短，对蛋白编码的传统计算机预测程序将sORFs列为假阳性。研究表明一些sORFs具有非经典的起始密码子和较低的序列保守性，因此在哺乳动物基因组汇中发现这些微小肽段是一个挑战。 应用新出现的技术和实验方法，研究者开始应对这个挑战。例如，Anderson等人发现一组微小肽段，命名为MLN、PLN、SLN。这些肽段具有相似的序列保守性，并且通过调节心肌钙的吸收抑制SERCA的活性。另两个微小肽段与MLN/PLN/SLN相似，被命名为ELN和ALN。对于SERCA相关的微小肽段调节的研究并未止步，在小鼠心脏中DWORFs的确认表明通过替代SERCA抑制剂PLN、SLN、MLN，能够提高SERCA的活性。截止目前，DWORF是唯一内源肽段可以通过物理作用激活SERCA。随着越来越多的微小肽段被确定，在心脏中微小肽段的数量以及它们是否具有相似的特征有待解答。例如，全基因组的研究在病理心脏中确定了微小肽段。有趣的是，这些微小肽段的整个编码序列不如传统的蛋白序列保守。这一研究提示许多从sORFs产生的微小肽段坐落在发挥功能的lncRNAs，例如Myheart、chaer、UPPERHAND、ZFAS1、TRDN-AS。尽管微小肽段的亚细胞定位是多变的，且大多数定位在线粒体，这也提示微小肽段在线粒体生物合成和功能中发挥重要的调节作用。的确，近期的研究发现MOXI这个微小肽段能够与MTP以及多个线粒体相关的复合体相互作用调节线粒体的功能，包括脂肪酸 b- 氧化、呼吸超级复合体形成和活动、钙离子滞留、活性氧种系形成。 确定越来越多的微小肽段用于未来对RNA调控网络的研究室很重要的，特别是确定lncRNAs的功能。为了进一步准确确定非编码基因的功能，探究lncRNAs功能过程中需要排除转录本的编码潜能。例如近期的研究确定了心肌发育过程中关键的lncRNAs：UPPERHAND。然而，编码sORF的潜能在人类和小鼠UPPERHAND中均被发现。因此需要进一步确定UPPERHAND是在RNA转录本还是微小肽段中发挥作用。或者需要进一步挖掘sORFs的基因组信息来确定非编码基因。许多方法如计算机分析、核糖体图谱绘制、质谱分析以及这些方法联合应用来准确的确定蛋白编码的sORFs。 表2 lncRNAs的心肌功能及分子机制总结表 RNA修饰的异常调节与心脏疾病 RNA分子在转录后经历复杂的修饰，m6A甲基化是真核生物mRNA内部最广泛的转录后修饰之一，通过修饰mRNA或者ncRNA参与调节生理和病理的活性。尽管m6A第一个被发现定位在mRNAs但是功能尚不明确。近期mRNA的m6A修饰在不同的生物学过程中变化和功能有许多报道。m6A修饰能促进不依赖帽子的mRNA翻译。m6A修饰在被一系列的甲基转移酶(METTL3/14、TAP、RBM15/15B、ZC3H13、KIAA1429、METTL16等)、去甲基化酶(FTO、ALKBH5等)以及m6A结合蛋白(YTHDF1/2/3、IGF2BP1、HNRNPA2B1等)沉积、转移和确定的过程中是变化的。越来越多的研究表明在N6-腺苷上的RNA甲基化的异常变化与肿瘤发生发展密切相关。截止近期，m6ARNA修饰与心脏疾病之间的关系需要进一步研究。Dorn等人的研究发现一系列mRNAs的m6A修饰在心肌细胞应对心肌肥大刺激时显著升高。METTL3作为N6-腺苷甲基化的一个重要酶，其过表达能够有效的引起适应性心肌肥大。相反抑制METTL3的表达能够抑制心肌细胞的肥大生长。此外，METTL3敲除的小鼠在年老和压力下逐步表现出病理的变化。有趣的是，发现m6A在MAPK mRNAs中特异表达，这对心肌细胞的肥大生长是非常重要的。在缺血的小鼠模型中，宋等人发现Mettl33的活性升高能够通过调节Tfeb 3’UTR的m6A修饰促进缺氧/再氧化处理的心肌细胞中HNRNPD与Tfeb pre-mRNA之间的相互作用，继而降低Tfeb mRNA的稳定性。这将抑制自噬流促进心肌细胞的凋亡。在另一项研究中，在哺乳动物心力衰竭和缺氧型心肌细胞中发现FTO表达的下调以及m6A RNA修饰的上调。重要的是FTO的过表达在缺血型心脏中起保护作用。结果显示FTO缺失能够引起异常的钙稳态和纹肌肌动蛋白的变化。相反，FTO过表达能够选择性提高收缩蛋白相关mRNAs的去甲基化，诱导表达。此外在FTO过表达的缺血心肌细胞中发现心肌成纤维化降低、血管生成提高。未来的研究可能会发现潜在的机制，这将导致MI新的治疗策略的确定。目前为止，mRNA的m6A修饰与心脏疾病相关，发现ncRNAs的m6A修饰是否参与心脏疾病的发生是非常有意义的。 mRNA翻译的增加是心肌重塑的关键步骤，包括AKT和AMPK的关键信号通路参与其中。与m6A修饰能够影响mRNA的转录活性相似，PABPC1 mRNA的polyA尾能够编码一个polyA结合的蛋白促进翻译，在调节自身mRNA翻译效率中起关键作用。成人心脏中Pabpc1 poly(A)尾的长度短于胚胎心脏，这一效应与在生理条件下成人心脏中Pabpc1的翻译沉默密切相关。变短的polyA尾在肥大心脏中回转，极大的提高了Pabpc1的翻译水平以及整个mRNA的翻译。不幸的是，这一修饰是如何调控的详细机制并未全面探究。 RNA分子是心脏疾病临床诊断和基因治疗的潜在靶向 探究心脏疾病中RNA调控网络的最终目标之一是利用RNA分子开发临床应用，将其作为疾病诊断/预后和治疗靶向的生物标记物。在心脏疾病中除了作为调控因子，ncRNAs同样与蛋白、脂质或者高密度脂蛋白相互作用形成RNA-蛋白复合体作为旁分泌因子发挥作用，这些复合体是稳定的，并且不易被RNA酶降解。因此血液中ncRNAs的不同表达水平有望作为心脏疾病诊断的生物标记物。 在AMI中有效的生物标记物对于评估梗塞后风险和治疗反应是非常重要的。病人血浆中miR-1、miR-126、cTnT的表达水平显著升高，这也提示miR-1和miR-126可作为有价值的指示因子。miR-499在心肌细胞中特异性表达并且只在AMI后升高。因此，miR-499可能是MI的重要生物标记物，特别是在NSTEMI。别的miRNAs，如miR-208、miR-133、miR-1254、miR-99a、miR-122-5p、miR-874-3p、miR-19b、miR-223、miR-483-5p同样可作为MI的生物标记物。lncRNAs作为心脏疾病生物标记物的潜能同样被研究。Vausort等人发现循环中的lncRNAs aHIF、KCNQ1OT1、MALAT1的水平在患者中明显较高，而lncRNA ANRIL的水平较低。近期的研究表明血浆中ANRIL的水平与ISR的高危相关。其他的证据提示HOTAIR、UCA1、MHRT、MIAT、LIPCAR、CDR1AS、ZFAS1能够作为AMI或者CAD诊断和治疗的潜在标记物。CircRNAs在循环的血液中含量丰富并且由于闭合的环状结构比线性RNAs更加的稳定。这些研究允许利用传统的方法进行circRNAs的检测。CircRNA MICA在MI患者的外周血中低表达，对472例AMI患者研究发现circRNA MICRA能够提高多个临床模型的预测价值，并且提高MI患者的风险分级。 研究者致力于挖掘临床诊断治疗心脏疾病的靶向和方法。尽管取得了很大的进展但是仍然不能满足临床的需求。RNA调控网络的许多研究，包括ncRNAs将会继续探究具有治疗价值的RNA靶向。RNA靶向具有独自的优势，并不依赖于检测的抗体以及合成转运相关的酶。因此，结合蛋白的靶向RNA调控网络的发现极大了引领临床心脏疾病应用的突破。 图1 RNA调控网络的分子机制图 结论与展望 人类基因组注释后，研究者惊奇的发现许多蛋白编码的基因和编码序列的长度与其他脊椎动物甚至非脊椎动物具有可比性。然而，人类含更多的非编码DNA序列，截止20年前开始探究ncRNAs，在心肌病理中的调控网络包含多达数的蛋白，似乎是冰山一角。在本综述中，研究者系统总结了RNA调控网络在心脏疾病中的主要发现，从人类基因组的暗物质探索开始。很明显，RNA分子是这些调控网络中不可缺少的成分。未来的研究将帮助我们更好的了解其潜在的分子机制（图1），更重要的是为击败心脏疾病奠定基石。 更多推荐 1 科研 | PNAS：转录组学揭示急性和慢性饮酒对肝脏昼夜新陈代谢有不同的影响
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