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编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读
杂种优势指杂交的F1代在抗病性、产量质量等性状上优于纯合亲本的生物学现象，广泛应用于作物和动物的选育上，然而其分子机制尚未研究清楚。关于杂种优势的遗传机制存在许多假说，包括超显性假说、显性连锁基因假说、上位假说、主效基因假说、遗传振动合成学说等。单分子杂种优势模型提出了一类等位基因相互作用导致某些杂种酶活性增加从而影响杂种优势。家蚕是研究杂种优势的良好模式生物，其幼虫期仅25d，繁殖环境易控制。研究表明杂种优势水平很大程度上由有益基因和有害基因的作用关系决定，有益基因和有害基因属于半显性基因。研究表明单交种的杂种优势高于双交种和三交种。而且遗传距离越大，杂种优势越大。亲本间差异越大，杂种优势的酯酶活性越大，产生杂种优势的可能性越大。目前关于家蚕杂种优势的理论基础较为薄弱。本研究选择中国的一个低产品系和日本的一个高产品系进行杂交育种，对比茧重、茧壳重和丝腺重，并评价了杂种优势。通过转录组学和蛋白质组学的联合分析，揭示家蚕杂种优势的分子机制。原名：Transcriptomics and proteomics-based analysis of heterosis on main economic traits of silkworm, Bombyx mori 译名：家蚕杂种优势性状的转录组和蛋白质组分析 期刊：Journal of Proteomics IF：3.509 发表时间：2020.08 通讯作者：陈克平 通讯作者单位：江苏大学生命科学学院 DOI号：10.1016/j.jprot.2020.103941 ① 家蚕杂交。家蚕亲本是中国菌株NB和日本菌株306，杂交构建F1代。对5日龄蚕进行体重、丝腺和茧壳重的测量，计算杂种优势率。保存丝腺进行后续转录组和蛋白质组分析。② RNA和蛋白质的提取与测序。TRIzol提取RNA，Illumina HiSeq进行转录组测序。尿素法提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳，进行液相色谱-串联质谱分析。③ 联合分析。筛选差异表达基因/蛋白，获得杂交种上调表达基因/蛋白，进行功能注释及GO/KEGG富集分析，联合杂种优势表型进行分析。本研究对5龄家蚕的亲本和杂交种的体重和丝腺进行测定，结茧后第10d测定茧壳重量。结果如图1所示，杂种的体重、丝腺和茧壳重显著高于纯合种，表现出超显性，杂种优势率分别为15.86%、12.84%和7.82%。
图1 杂种优势性状的表型。a：体重；b：丝腺；c：茧重。质控后共获得48.3 GB的clean reads，87.78%比对至参考基因组。共检测到40976个转录本，200-800bp的转录本占49.22%，800-1800bp的转录本占24.52%，> 1800bp的转录本占22.29%（图2a）。各样品的整体表达水平相似且FPKM值接近1.0，且生物学重复间的相关性高，表明转录本数据的可靠性（图2 b-c）。主成分分析显示生物重复间相似性高，重复性好（图2d）。在纯种和杂种的转录组中共检测到10599个基因，其中2001个超显性基因、863个显性基因、275个加性基因、5303个非加性基因，非加性效应最为显著（图3）。因此，蚕丝产量的杂种优势主要由基因非加性效应引起。杂种中共得到292个表达显著升高的差异表达基因，GO富集于'代谢过程’、'细胞膜组分’、'催化活性’（图4a）。此外，蛋白质水解、肽酶活性、核酸内切酶活性、水解酶活性显著富集（图4d）。对292个基因进行KEGG分析，发现它们参与脂质代谢、碳水化合物代谢、信号转导、内分泌系统、消化系统等通路（图4c）。上调基因主要参与甾体激素生物合成、抗坏血酸和糖醛酸代谢、视黄醇代谢、细胞色素P450代谢（图4b）。在杂种中获得160个表达显著降低基因，显著富集于ncRNA和tRNA加工代谢过程、脱氧核糖核苷酸生物合成过程、DNA复制和氧化还原酶活性（图5a），参与内分泌系统、信号转导、翻译、核苷酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢（图5b）。家蚕杂种和纯种的韦恩图分析表明，有105个基因在杂种中特异表达，这些基因在纯种中未检测到（图6）。富集分析表明特异表达基因富集于蛋白水解、丝氨酸型肽内切酶活性、肽酶活性、肽内切酶活性和水解酶活性，主要参与碳水化合物代谢、辅酶和维生素代谢、信号转导和内分泌系统。因此，家蚕杂种优势主要与体内代谢和催化功能有关。选择10个差异表达基因进行RT-qPCR验证，与转录组结果一致（图7）。
图2 转录组测序质控。a：转录本长度分布统计；b：转录组整体表达水平；c：基因表达水平相关性；d：表达水平主成分分析。
图3 基因表达模式的转录组分析。x轴表示各种表达模式，y轴表示检测到的具有这种表达模式的基因数量。
图4 上调基因的GO和KEGG分析。a：GO富集功能注释；b：KEGG富集通路；c：KEGG富集功能注释；d：GO富集途径。
图5 下调基因的GO和KEGG分析。a：GO富集；b：KEGG功能注释；c：KEGG富集途径。
图6 杂种特异表达基因分析。a：表达基因的韦恩图；b：GO富集；c：KEGG功能注释；d：GO富集途径；e：KEGG富集通路。
本试验共鉴定1942个表达蛋白，其中超显性蛋白558个、显性蛋白208个、非加性蛋白796个（图8），该比例与转录组非常相似。杂种中有176个蛋白显著上调表达，这些蛋白质主要属于膜组分、参与催化活性和结合、气味结合、肌动蛋白纤维组织、钙离子结合、细胞骨架蛋白结合、肌动蛋白结合等功能（图9）。KEGG分析表明这些蛋白在代谢、细胞过程、遗传信息处理、环境信息处理和生物系统5类途径中富集。KEGG富集分析显示这些蛋白在过氧化物酶体、咖啡因代谢、长寿调节途径、药物代谢酶、糖胺聚糖降解、转录等途径中显著富集。这一结果与转录组分析结果一致。在杂种中得到308个表达显著下调蛋白。GO富集表明下调蛋白主要富集于转录调控、细胞蛋白复合物组装、RNA生物合成过程（图10）。KEGG富集分析表明这些蛋白在MAPK信号通路、真核生物核糖体生成和嘌呤代谢中均显著富集。对家蚕杂种和纯种家蚕进行韦恩图分析得到杂种中有10个蛋白特异表达，这些蛋白在纯种家蚕中没有检测到（图11）。这些特异表达的蛋白主要集中在多生物过程、细胞溶解、细菌防御反应、溶菌酶活性等。
图8 蛋白表达模式的分类统计。横坐标为各种表达模式，纵坐标为每种表达模式下的蛋白数量。
图9 上调蛋白的GO和KEGG分析。a：GO注释；b：GO富集；c：KEGG富集通路；d：KEGG功能富集。
图10 下调蛋白的GO和KEGG分析。a：GO富集；b：KEGG注释；c：KEGG富集。
图11 10个特异性杂种蛋白的注释。a：蛋白质组的韦恩图分析；b：GO富集；c：蛋白表达水平聚类。家蚕体重、丝腺和茧重等主要经济性状的杂种优势明显。通过GO富集分析明显上调的基因和蛋白，发现这些基因主要富集于能量代谢、碳水化合物代谢、蛋白水解、肽酶活性、水解酶活性、丝氨酸型酶活性、磷酸戊糖途径、甾体激素生物合成、药物代谢-细胞色素P450等。丝蛋白的合成包括蛋白质多肽链的合成、丝腺对营养物质的吸收、丝腺的代谢、丝蛋白的主动转运到细胞外秘密等，这些都需要足够的能量。激素的主要作用可能是提高丝纤蛋白mRNA的合成率，从而加速基因转录，增强丝纤蛋白合成能力，实现高效产丝。类固醇激素的合成可以调节身体平衡，维持血压。细胞色素P450是一种多功能氧化还原酶，可促进杂种类固醇激素的合成。通过类固醇激素和一系列激素的产生，推测可以加快杂种的能量代谢水平，缩短细胞周期，改善个体体重和丝腺发育。杂种中上调基因在丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸水解酶活性和丝氨酸型肽酶活性等功能显著富集。丝氨酸蛋白酶是昆虫体内重要的一类水解酶，参与昆虫消化、胚胎发育、组织重建、细胞分化、血管形成、血液凝固、免疫应答、激素激活等多种生理生化过程。丝氨酸是丝素蛋白和丝胶蛋白中含量较大的氨基酸，丝氨酸相关酶的较高活性可大大提高丝蛋白的合成率，从而导致丝腺和产丝的杂种优势。结合转录组和蛋白质组结果，有6个基因表达上调，KEGG分析表明这些基因与酶代谢有关。其中HSP20基因的主要功能是在细胞中作为分子伴侣，调节蛋白折叠、蛋白转运、免疫应答，抑制凋亡信号通路，保护细胞免受应激、衰老和细胞周期调控。推测sHSP20.4可以促进丝蛋白的运输和细胞运动，提高丝蛋白合成速度。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因（G6PDH）是一个关键限速酶，调节戊糖磷酸途径，被称为'管家酶’。较高的NADPH水平会提高NADP代谢水平，从而提高生物合成、氧化和抗氧化代谢水平，使杂种的生长能力和环境耐受性较亲本有所提高。表面糖蛋白磷脂酶基因（VSG-PLC），主要作用于磷酸二酯和磷脂酰肌醇的水解，促进脂质分解，在磷脂代谢中发挥重要作用。BGIBMGA013342基因编码一种载脂蛋白，是家蚕生长发育过程中主要的贮藏蛋白，参与家蚕体内脂质物质的运输，将90%的脂质输送到内脏。BGIBMGA013261基因编码磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP），可抑制MAPK信号通路的活性，并参与PKC系统的信号转导，活化的PKC可激活多种靶蛋白，调控细胞代谢、基因表达、细胞分化增殖和蛋白磷酸化。联合分析得到4个下调基因。BGIBMGA000542基因编码UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶（UXS1），这种酶存在于真菌细胞质中，也存在于植物细胞质和高尔基体，参与合成植物细胞壁多糖，如木聚糖和木葡聚糖。BGIBMGA006772基因编码热休克蛋白（HSP70），与其他伴侣蛋白互作，促进蛋白折叠，协助前体蛋白转位到细胞器，并负责胁迫条件下损伤蛋白的降解。BGIBMGA009685和BGIBMGA004923基因分别编码适应性蛋白和ras相关蛋白。适应性蛋白参与细胞内蛋白转运和囊泡介导转运，在介导蛋白进入细胞膜和识别跨膜分子信号发挥作用。ras相关蛋白参与细胞内囊泡的运输和蛋白运输。这些基因均与细胞内转运蛋白有关，说明杂种优势的产生可能与细胞内转运相关蛋白表达的减少有关。家蚕杂种的应用促进农业生产发展，但家蚕杂种优势形成的机理尚未阐明。本研究通过家蚕杂交和转录组、蛋白质组的方法，研究家蚕的杂种优势。结果表明大部分上调基因/蛋白主要与代谢有关，加速代谢和蛋白合成，有助于提高杂种优势。参与代谢的6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）、磷脂酰乙醇胺结合蛋白（PEBP）、热休克蛋白（HSP70）的上调可能与丝腺杂种优势有关。
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