【原】科研 |NAT NANOTECHNOL：不同电荷的纳米塑料在拟南芥中表现出明显的积累（国人佳作）

转录组 2021-04-20

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编译：艾奥里亚，编辑：景行、江舜尧。

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导读

尽管微塑料（尺寸为0.1-5 mm）和纳米塑料（<100 nm）在海洋环境中的归趋被众多研究学者所关注，但有关纳米塑料在陆地环境中的行为，特别是农业土壤中的环境行为却知之甚少。以前的研究探究了纳米塑料在水生植物中积累的后果，但没有直接证据表明纳米塑料在陆地植物中的内在化。

本研究证明了带正电荷和带负电荷的纳米塑料都可以在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中积累。生长介质和根系分泌物促进的团聚限制了氨基改性聚苯乙烯纳米塑料的吸收。因此，带正电的纳米塑料在根尖积累的水平相对较低，但与磺酸改性的带负电纳米塑料相比，带正电的纳米塑料诱导了更高的活性氧积累，并更强烈地抑制了植物的生长和幼苗的发育。相反，非原生质体部分和木质部中可常见带负电荷的纳米塑料。本研究的发现为证明纳米塑料可以在植物体内积累提供了直接的证据，这取决于它们的表面电荷分布。纳米塑料的植物积累既可以产生直接的生态效应，也可以对农业的可持续性和食品安全产生影响。

论文ID

原名：Differentially charged nanoplastics demonstrate distinct accumulation in Arabidopsis thaliana

译名：不同电荷的纳米塑料在拟南芥中表现出明显的积累

期刊：nature nanotechnology

IF：31.538

发表时间：2020年6月

通讯作者：袁宪正，王曙光，邢宝山

通讯作者单位：山东大学，马萨诸塞大学

DOI号：10.1038/s41565-020-0707-4

实验设计

在无菌土壤中分别添加两种制备好的纳米塑料，使其终浓度设定为0，0.3，1 g kg^-1；对于固体培养基上生长的植株，种子在含有0.8%琼脂和1%蔗糖的半强度MS固体培养基(13 cm×13 cm)上萌发。纳米塑料在半强度MS培养基中的暴露浓度分别为0，10，50和100 μg ml^-¹。用扫描仪对牙根进行成像，并在暴露10天后使用ImageJ软件测量初级牙根长度。这些植物的根暴露在纳米塑料中4天，在半强度的MS培养基中，用碘化丙啶染色进行活性测试。此外，植物与带有荧光标记的纳米塑料共培养7天后，采用共聚焦成像来跟踪纳米塑料在根部的位置。

结果

1 纳米塑料表征及其对植物生理的影响

本研究采用微乳液聚合法合成了两种功能化聚苯乙烯纳米塑料，即PS-SO₃H（55 ± 7 nm）和PS-NH₂（71 ± 6 nm）（图1a-d）。PS-SO₃H和PS-NH₂在去离子水（pH5.9）中的zeta电位分别为-46.8 ± 1.8 mV和+28.1 ± 2 mV。动态光散射（DLS）结果证实了它们在去离子水中的最佳分散和稳定性（图1b）。接下来，研究者在混合了PS-SO₃H或PS-NH₂的土壤中种植拟南芥（Arabidopsis thaliana），发现这两种类型的纳米塑料都影响了拟南芥的表型（图1e）。7周后，0.3 g kg^-¹和1.0 g kg^-¹PS-SO₃H处理的植物地上部分鲜重分别比对照降低41.7%和51.5%（P<0.05；图1f）。PS-NH₂暴露后也观察到类似的结果（P<0.05；图1f）。暴露于1.0 g kg^-1PS-NH₂的植株显著短于对照和暴露于0.3 g kg^-1纳米塑料的植株（P<005），植物siliques中叶绿素含量显著低于对照（P<005；图1g, h）。

由于拟南芥的根部对外界刺激高度敏感，因此研究人员还对在固体培养基中生长的拟南芥幼苗进行了分析。在半强度Murashige和Skoog（MS）基本培养基中，拟南芥幼苗分别与浓度为10，50和100 μg ml^-1的纳米塑料共培养10天后，幼苗生长受到抑制（图1i，j）。在所有浓度下，这些植物的初生根生长均显著低于对照（P<0.05），且在较高浓度时抑制程度较大（P<0.01）。同样，对幼苗根部生长的抑制效果依赖于纳米塑料的电荷。研究还证实，透析后悬浮液中的残留化学物质不会影响根的发育。总体而言，本研究的结果表明，暴露在PS-NH₂中的拟南芥的生理变化比暴露在PS-SO₃H中的生理变化更显著。

图1. 纳米塑料表征及其对植物生理的影响。a代表PS-SO₃H和PS-NH₂的透射电镜图；b通过DLS测定了PS-SO₃H和PS-NH₂在水溶液中的粒径分布；c代表PS-SO₃H和PS-NH₂在半强度培养基中的稳定性情况；d采用傅里叶红外对PS-SO₃H和PS-NH₂进行表征；e-h代表不同浓度处理下植物的生长；i-j代表植物与不同浓度纳米塑料共培养10天及根长。

2 RNA-Seq转录分析

为了探究上述效应的分子机理，研究人员对培养基中培养的根和幼苗进行了RNA-Seq转录分析。基于变化的的转录本数量（上调和下调），PS-NH₂比PS-SO₃H对基因表达的影响更大。当根暴露在PS-NH₂中时，主要上调的GO包括含有花青素的化合物和类黄酮的生物合成和代谢过程，这些合成过程能够在非生物胁迫下清除自由基。对于PS-SO₃H而言，三萜、单一生物体和萜类的代谢过程是主要的上调过程，这些过程可以对环境条件作出响应并诱导防御响应。两个功能性纳米塑料暴露下的植物的主要下调过程都涉及活性氧（ROS）的代谢过程以及对刺激和压力的响应，这是由各种抗氧化系统的相互作用的结果。PS-SO₃H处理的根系中有4种过氧化物酶表达下调，而PS-NH₂处理的根系中有9种过氧化物酶表达下调。PS-NH₂处理增加了根系过氧化物酶的表达，导致过氧化物产生增加，表明根系中的ROS增加。同样，在地上部基因转录本中，PS-NH₂诱导的GO上调表明了其对拟南芥光合作用、生长、存活和竞争优势的影响。PS-SO₃H暴露诱导的主要GO上调表明，拟南芥受到非生物因素和水分剥夺的胁迫。PS-NH₂和PS-SO₃H暴露下调的主要GO参与了对DNA结合和病原体的响应。两种纳米塑料处理的幼苗都表现出抗病基因的下调，这表明PS-SO₃H和PS-NH₂处理可能会降低植物的抗病性。KEGG分析和GO富集分析同样观察到类似的结果。

3 定量PCR（qPCR）分析

为了验证上述RNA-Seq结果，研究人员对3种不同的根部过氧化物酶相关基因和4个地上部抗病相关基因进行了定量PCR（qPCR）分析。这些表达数据表明了RNA-Seq数据的准确性。这些结果表明，纳米塑料处理的拟南芥植株中过氧化物酶的产生和植物抗病性都受到了损害。为了进一步鉴定ROS的RNA-Seq序列结果，采用 3,3-diaminobenzidine（DAB）和nitroblue tetrazolium（NBT）分别对根进行染色，以分析H₂O₂和O₂^-的产生。与对照和残留物处理的植物相比，纳米塑料处理后H₂O₂在根尖和根成熟区得到积累（图2a）。PS-NH₂处理的根中H₂O₂的积累比PS-SO₃H处理的根中H₂O₂的积累更明显，这与RNA-Seq结果一致。然而，O₂^-的变化在不同纳米塑料处理之间无显著差异（图2b）。

4 根部ROS的分布及根部组织形态学

由于高ROS水平抑制了根的生长，研究者在显微镜下对根冠的亚尖区、增殖区、过渡区和细胞成熟区的组织形态进行了观察。在这些区域中，增殖区域和过渡区域共同形成根尖分生组织。PS-NH₂处理后，边缘状细胞很容易从根冠中释放出来（图2c）。此外，纳米塑料改变了根表皮细胞的形状（图2c），导致根成熟区膨胀（图2d）。PS-NH₂（10，50 μg mL^-¹）和PS-SO₃H（50 μg mL^-¹）处理的根尖分生组织显著短于对照（图2e）。此外，50 μg mL^-¹纳米塑料处理的根成熟区细胞长度显著短于对照（图2f）。在纳米塑料处理的植物中观察到的成熟区的变化可能会阻止根毛的吸收以及水分和养分的运输，导致与缺水相关GO的下调，从而降低植物鲜重（图1f）。根冠和表皮细胞是产生粘胶的重要结构，可以润滑根部，影响离子吸收，并将土壤颗粒粘合到根部。细胞分裂的中断可能是导致根形态异常的另一个原因，这可能导致细胞的各向同性生长和根的肿胀。

图2. 根部ROS的分布及根部组织形态学。a-b代表分别采用DAB和NBT对半强度MS培养基中，与纳米塑料共培养7天后的拟南芥进行染色；c-d分别代表用碘化丙啶染色的有代表性的根系图像；e代表根尖分生组织长度；f代表成熟区细胞的长度。

5 纳米塑料的吸收和根系响应

进一步，研究者对纳米塑料进行荧光标记，以探究纳米塑料是否可以被植物吸收，通过研究发现，其行为与本研究中合成的纳米塑料在半强度MS介质中的行为相似。将幼苗移植到含有表面带负电荷的红色荧光标记的羧基改性聚苯乙烯纳米塑料（PS-COOH；200 nm）的培养物中7天后，在植物根部观察到红色荧光，其荧光主要是在成熟区的中部，而不是在根尖（图3a）。在根尖部分，PS-COOH主要吸附在边缘细胞上，沿根面排列。此外，大量红色荧光附着在根表面和根毛以及细胞间隙（图3a）。这些结果表明，表面带负电荷的纳米塑料可能被成熟区的根毛吸收，并通过质外体途径内化到中部。然而，将幼苗移植到含有绿色荧光标记的氨基改性聚苯乙烯纳米塑料（PS-NH₂-F；200 nm）的培养物中后7天，其荧光主要分布在根表皮和根毛中，在根组织中观察到相对较少的绿色荧光（图3a）。为了进一步证实纳米塑料的吸收，研究者用金属掺杂的聚苯乙烯纳米塑料（PS-PD；160 nm，表面带负电荷）在没有对拟南芥产生负面影响的情况下来增加纳米塑料在根中的对比度。通过比较植物组织中的电子显微镜结果，进一步证实了PS-PD在根组织中的存在，主要分布在木质部的表皮细胞和导管中（图3b）。这与共聚焦成像结果高度一致，表明纳米塑料可以吸附在根部表面，并在中部内积累。

图3. 纳米塑料的吸收和根系响应。a代表拟南芥与纳米塑料共培养7天后PS-COOH （红色荧光）和PS-NH₂-F （绿色荧光）在根部的定位；b代表处理和对照组植物STEM图像；c代表拟南芥根中摄取不同电荷的纳米塑料，以及响应于纳米塑料而诱导的植物防御机制。

由于根系分泌物也会影响纳米颗粒的生物利用性，为了确定上述累积差异的潜在原因，研究人员进一步对根系分泌物进行测定，发现拟南芥根系分泌的低分子量有机酸（LMWOA）主要是草酸。用50μg mL^-1的PS-NH₂处理的植物分泌的草酸大约是对照的2.6倍。此外，与PS-SO₃H处理相比，PS-NH₂处理下草酸的分泌量更大，说明纳米塑料的表面电荷可以影响根系分泌物的分泌。在半强度MS溶液和草酸盐存在下，纳米塑料呈现出不同的聚集趋势。DLS数据显示，带正电的纳米塑料聚集体尺寸随着草酸浓度的增加而增加，而带负电的纳米塑料尺寸保持不变。纳米塑料的聚集可能会影响它们的迁移和吸收。PS-NH₂颗粒聚集体的大尺寸可能导致难以穿透根组织。

本研究代表了对陆地植物中纳米塑料内化的探究。在不考虑表面电荷的情况下，拟南芥可以吸收和运输尺寸小于200纳米的纳米塑料。然而，如果没有进一步的研究，很难确定陆地环境中的纳米塑料可以被植物吸收的颗粒大小。本研究主要证明了不同电荷的纳米塑料在根组织中吸收和运输的途径不同（图3c）。尽管带正电的纳米塑料（PS-NH₂）对根系有较强的影响，但其吸收和内化作用低于带负电的纳米塑料。PS-NH₂刺激根系产生高水平的分泌物，影响了PS-NH₂的稳定性，限制了拟南芥对PS-NH₂的吸收。根表皮损伤可能是由于根分泌物中残留正电荷的溶解以及静电作用使PS-NH₂能够附着在植物上（从而增加了PS-NH₂的局部浓度）所致。根毛对纳米塑料的吸附也会影响水分和养分的运输，导致地上生物量减少。

结论

本研究结果将有助于人们更好地了解纳米塑料在陆地植物中的行为。其他植物，特别是根茎作物（如胡萝卜、萝卜和防风草）吸收和积累纳米塑料的可能性以及随后产生的负面生理效应也值得研究。陆生植物构成了许多食物链的基础，因此，纳米塑料在植物体内的积累可能会影响到其他营养水平，这可能会对粮食产量、质量和安全构成潜在风险。然而，陆地环境中的纳米塑料很大程度上是由宏塑料和微塑料的分解而来的。由于风化和化学降解，这些纳米塑料的物理和化学性质与本研究中使用的原始纳米塑料不同。老化的纳米塑料在陆生植物中的内化和转运需要进一步的研究。