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编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 精氨酸（Arg）在植物发育和生长过程中起到很大的作用，但是关于他在草莓果实发育和生长起到的调控作用还不是十分清楚。本研究发现草莓果实着色后Arg含量降低，外源Arg抑制果实着色。研究者对Arg处理和没有Arg处理的草莓果实进行了全面的转录组分析，并鉴定到了大量的差异表达基因和代谢产物。作者还发现Arg对果实成熟有抑制作用，这与生理参数变化一致，包括果实硬度、花青素含量、糖含量、吲哚乙酸（IAA）含量、脱落酸（ABA）含量等。同时，研究者发现Arg会降低热激蛋白（HSPs）基因和抗氧化酶先关基因的表达量，提高草莓抗热性。本研究阐明了Arg延缓草莓果实成熟的分子机制，为草莓进一步改良和栽培提供遗传信息。 论文ID 原名：Transcriptome analysis of strawberry fruit in response to exogenous arginine 译名：转录组分析研究草莓果实对外源精氨酸的应答 期刊：Planta IF：3.39 发表时间：2020年10月 通讯作者：贾海峰 通讯作者单位：南京农业大学，园艺学院遗传与果实发育重点实验室 DOI号：10.1007/s00425-020-03489-w 实验设计 结果 根据前人研究，草莓果实发育可分为7个阶段：小绿（SG）、大绿（LG）、脱脂（DG）、白色（Wt）、初红（IR）、偏红（PR）和全红（FR）（图1）。HPLC分析表明，精氨酸（Arg）含量从SG期到FR期逐渐降低，并在FR期达到最低水平（图1）。在果实成熟过程中，其他14中氨基酸含量也逐渐降低，如天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等。这些结果表明，精氨酸在草莓果实发育过程中起到重要作用。 图1.草莓果实七个发育阶段的精氨酸含量。用高效液相色谱法测定精氨酸含量。每个阶段用3个果实进行检测。 2 精氨酸对草莓果实成熟的影响 为进一步确定Arg在草莓果实成熟中的作用，研究者选择了20个DG期的果实并进行Arg处理（图2a）。对照组采用无菌水处理8天，观察全红、2/3红和1/3红的比例。精氨酸和无菌水处理果实的比例分别为7：28：10，33：10：2（图2d）。结果表明，与对照组相比，Arg延缓了果实膨大（图2b）。外源精氨酸显著促进了内源精氨酸的积累，促进了Put含量的积累，但对Spm和Spd的含量没有显著影响（表1）。为了解Arg对果实着色的影响，研究了几种与成熟相关的植物激素的含量（表1）。与对照组相比，外源Arg会抑制乙烯释放和ABA积累，促进IAA积累（表1）。同时，Arg也会延缓果实软化（图2c）。以上结果表明，Arg对草莓果实着色的影响可能与ABA、乙烯和IAA有关。 图2. Arg对草莓果实着色的影响。20个DG期草莓果实进行200μM精氨酸处理，无菌水作为对照。a.处理前后DG期草莓果实表型。b.花青素含量。c.果实硬度。d.每个处理下每个表型的果实数量。 表1. 草莓果实Arg处理后生理指标变化。 3 精氨酸处理后转录组分析 为了研究Arg促进草莓果实成熟的分子机制，研究者进行了转录组测序分析。Arg处理和对照组分别产生了460M和433M的raw reads，过滤后有40357430和42829134条clean reads。共鉴定到108087个基因，并根据表达量水平进行分组（图3a），其中有28503个基因的表达量大于1。为验证实验的可靠性，研究计算了各个样本间的基因表达水平的相关性系数（图3b），并进行了主成分分析（图3c）。
Arg处理和对照组中共鉴定到4419个差异表达基因，其中有1826个上调表达，2593个下调表达（图4a）。对差异表达基因绘制火山图，以展示上调和下调差异表达基因的差异性（图4b）。 4 GO和KEGG分析 为确定DEG的生物学功能，对DEG进行了GO分析。将其主要分为三个功能类别：分子功能（MF）、细胞组分（CC）和生物过程（BP）。共有2163个DEG注释到GO数据库的2881个GO terms上，其中包括833个MF terms，1780个BP terms和268个CC terms。BP中富集最多DEG的GO terms为“代谢过程”和“细胞过程”，MF分类中“催化活性”和“绑定”是富集醉倒DEG的GO terms，CC中富集醉倒DEG的GO terms为“细胞膜”和“细胞”。在所有GO terms中，选择了富集程度最显著的10个terms绘制图5a。根据GO富集，有一些与果实成熟相关的terms，包括“DNA结合转录因子活性”，“催化活性”和“转移酶活性”等。同时进行了KEGG分析，作者将DEG注释到KEGG数据库中。共有1701个DEG富集到116条KEGG通路中。大量参与“植物激素信号转导”，“植物-病原菌互作”，“苯丙酸生物合成”的DEG被注释到KEGG通路中。最显著富集的前20条KEGG酮绘制5b。
5 参与细胞壁代谢的DEG 共鉴定到52个DEG，包括多聚半乳糖醛酸酶（PG），β-半乳糖苷酶（β-Gal）、果胶酯酶（PE）、果胶酯酶抑制剂（PEI）等（表2）。在Arg处理中有5个上调基因和6个下调基因参与PG合成。在Arg处理后，β-半乳糖活性显著升高，有7个上调基因和2个下调基因。与对照组相比，XTH相关的有8个上调基因和1个下调基因。EXP是一种与植物细胞壁松弛的蛋白质，许多研究表明，EXP成员对果实有不同的影响。已检测到EXPA8、EXPB18和EXPB2显著下调表达，而EXLA2上调表达。 表2. Arg处理下细胞壁软化相关基因的变化。 6 植物激素对Arg处理的响应 植物激素在草莓果实的生长发育中起着至关重要的作用。在研究中，鉴定到了很多与IAA、细胞分裂素、GA、BR、JA、乙烯、SA和ABA合成以及信号转导途径有关的基因。在Arg处理组中，生长素生物合成过程中两个胰蛋白酶原氨基转移酶相关蛋白1（TAA1）基因上调。生长素信号转导过程中，生长素应答蛋白（AUX/IAA）（1个下调，3个上调）和生长素转运蛋白样蛋白（AUX/LAX）（4个上调）显著上调。此外，生长素应答因子（arf）在精氨酸处理后也有7个上调基因上调（表3）。在Arg处理下，BR信号转导中3个下调基因和1个上调基因的BR信号激酶（BSK）下调（表3）。在JA代谢途径中，发现18个DEGs，其中14个在Arg处理后下调（表3） 表3. 8种植物激素合成及信号转导的差异表达基因。ABA2黄毒素脱氢酶、ACO 1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶、ACS 1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶、Ald3脱落醛氧化酶、AOC-烯氧化环化酶、AOS-烯氧合酶、ARF-生长素应答因子、AUX/IAA生长素应答蛋白、AUX/LAX生长素转运体样蛋白，BSK-BR信号激酶、CKX-细胞分裂素脱氢酶、ERFENE应答转录因子、ETR-乙烯受体、GA-20赤霉素20氧化酶、GA3β-赤霉素3-β-双加氧酶、GA2β-赤霉素2-β-双加氧酶、GID1赤霉素受体GID1、IPT腺苷酸异戊烯基转移酶、茉莉酸JAZZIM结构域蛋白，JMT茉莉酸O-甲基转移酶，MMK1丝裂原活化蛋白激酶同源物MMK1，OPR12-氧代苯二甲酸还原酶，SDR短链型脱氢酶/还原酶，PAL苯丙氨酸解氨酶，PP2C磷酸酶2C，PYL脱落酸受体PYL，PYR脱落酸受体PYR，色氨酸相关转氨酶。 ABA是一种重要的促进果实成熟的激素。本研究中鉴定到三种ABA从头合成的酶，短链脱氢酶/还原酶（SDR）、黄毒素脱氢酶（ABA2）和脱落醛氧化酶（ALDO3）编码基因在Arg处理下上调。此外，ABA受体PYR/PYL显著下调，ABA信号转导中的磷酸酶2C（PP2C）上调（表3）。对乙烯生物合成关键的1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶（ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（ACO）进行了鉴定，发现两个ACS基因表达上调，3个ACO基因下调。在乙烯信号转导途径中，鉴定出2个乙烯受体（ETR）和41个乙烯应答转录因子（ERF）（39个下调，2个上调）。在精氨酸处理的果实中，乙烯不敏感蛋白2（EIN2）上调（表3）。SA和细胞分裂素代谢途径中也分别发现了4个和6个DEG，其中大部分下调（表3）。在GA生物合成中，赤霉素20氧化酶（GA-20）（1个上调）、赤霉素3-β-双加氧酶（GA3β）（2个上调）和gib-berellin 2-β-双加氧酶（5个下调）。此外，在Arg处理后的GA信号转导中发现了一个上调基因的赤霉素受体GID1（表3）。 7 精氨酸处理对花青素和类胡萝卜素代谢的影响 草莓的颜色变化主要取决于果实中花青素和类胡萝卜素的积累。花青素属于影响草莓果实发育和成熟的一类黄酮类化合物。在本研究中，在花青素合成途径中发现了10个DEGs，其中9个下调基因和1个上调基因响应Arg处理（图6）。苯丙氨酸解氨酶1（PAL1）和4-香豆蔻酸-CoA连接酶1（4CL1）是植物类黄酮合成的原始底物，在苯丙氨酸代谢途径中发现了关键酶。PAL1和4CL1活性下降，分别有2个下调基因和1个下调基因。在花青素生物合成过程中，白花青素还原酶（LAR）和二氢黄酮醇-4-re-导管酶（DRF）活性下降，而花青素还原酶（ANR）活性升高。糖基化酶-3（UDP-gt）处理后，5个糖基化葡萄糖（UDP-gt）基因也受到调控。在类胡萝卜素生物合成途径中，zeta-胡萝卜素去饱和酶（ZDS）和植物烯合成酶（PSY）在KEGG富集途径中富集。
8 精氨酸处理下内源精氨酸与蔗糖代谢 谷氨酸合成相关酶，如谷氨酸脱氢酶（GDH）和天冬氨酸转氨酶（AAT）参与精氨酸的生物合成。它们的活性都随着一个上调的基因而增加，而乙酰谷氨酸激酶（NAGK）活性下降（表5）。Arg脱羧酶（ADC）的活性随着一个下调的基因而降低，而鸟氨酸脱羧酶（ODC）途径中的精氨酸酶（ARGI）在Arg处理下上调（表5）。
表5. 精氨酸和蔗糖代谢相关基因的差异表达。AAT：天冬氨酸转氨酶；ADC：精氨酸脱羧酶；AGL：α-葡萄糖苷酶；ARGI：精氨酸酶；BAM：β-淀粉酶；GBE：1,4-α-葡聚糖分支酶；GDH：谷氨酸脱氢酶；NAGK：乙酰谷氨酸激酶；SPDS：亚精胺合酶；SPS：蔗糖磷酸合成酶；SS：蔗糖合成酶；SSY：淀粉合成酶。 在Arg处理后，共鉴定出24个DEGs，其中16个基因上调，8个基因下调。。蔗糖合成过程中的两个关键酶蔗糖合成酶（SS）（一个上调基因）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）（两个上调基因）与对照组相比活性增加。 9 精氨酸处理对热休克蛋白和抗氧化酶的影响 热休克蛋白（HSPs）是一种应激反应蛋白，起分子伴侣的作用，保护植物免受伤害。共鉴定出41个HSP基因，包括9个HSP90-1、18个小热休克蛋白（sHSPs）、3个90kda热休克蛋白激活子和11个热应激转录因子（Hsfs）。18个DEGs被鉴定为sHSPs，包括7个上调基因和1个下调基因。11个Hsfs表达水平不同，其中6个表达上调，5个下调（表6）。 此外，还鉴定了一些抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（Prx）等。本研究在DEGs中检测到两种SODs：Cu/Zn-SOD（一个下调）和Fe-SOD（两个上调）。POD在过氧化氢直接还原为水和氧的过程中起着重要作用。
10 Arg响应转录因子 在植物中，TFs在基因表达调控中起着重要作用。它们与靶基因上游的各种特定DNA元件结合，并激活或抑制靶基因的转录活性，以调节其空间-时间特异性表达。在本研究中，作者共鉴定出2714个精氨酸反应性TFs，属于55个不同的TF家族。被注释为TFs的DEGs有1606个下调基因和1108个上调基因。bHLH家族的DEGs最多，其次是NAC、MYB-related、ERF、WRKY和C2H2。在所有的TF家族中，bHLH所含的DEGs最多，达267个，其中115个上调，152个下调。在MYB调节家族中，经Arg处理后139个基因表达下调，80个基因表达上调。 11 qRT-PCR验证 选择与花青素、细胞壁代谢和植物激素相关的21个DEGs进行qRT-PCR。苯丙氨酸、苯丙氨酸和苯丙氨酸的代谢途径均下调。此外，PG在细胞壁代谢中也有下调作用。与JA和乙烯过程有关的7个基因表达下调，而IAA基因表达上调。在ABA过程中，PP2C16表达显著上调，而PYL4表达下调。qRT-PCR结果与转录组分析鉴定结果一致，表明转录组分析结果的可靠性（图7）。
图7. qRT-PCR结果 讨论 果实成熟是一个极其复杂、有序的生理生化过程。它与多种酶及转录因子、植物激素、环境等多种因素的联合作用有关，导致植物的表型、物质含量和组成发生变化。 精氨酸（Arg）是植物生长发育过程中的重要氨基酸。它是种子中氮储存的最重要形式并通过形成PAs和NO信号分子来调节植物生长和提高抗逆性。草莓果实发育过程中，精氨酸含量持续下降，外源精氨酸处理使内源精氨酸含量显著高于对照。说明Arg含量在草莓果实成熟过程中起着重要作用。Arg处理抑制草莓果实着色，提高果实硬度，表明Arg抑制草莓果实着色和软化。 细胞壁结构、组分和相关降解酶的变化与果实成熟和软化密切相关。PG和PE在调节果实软化中起协同作用。在本研究中，PG的表达和作者的研究结果一致。这可能证实PG和PE在草莓果实软化过程中起着调节作用。在作者的研究表明，经过精氨酸处理后，XTH显著上调，促进了XTH的合成。因此推测XTH在抑制草莓果实软化中起到了积极的作用。此外，β-Gal在番木瓜硬度损失中起重要作用。草莓在裂果过程中半乳糖含量降低。结果表明β-Gal参与了果实成熟过程。与以往的研究结果不同，Arg处理后β-Gal促进了草莓果实软化，表明β-Gal对草莓果实软化有积极的抑制作用。EXP是成熟果实细胞壁软化所必需的，其在软草莓果实中的表达丰度高于硬果。实验结果表明，精氨酸抑制了果实软化过程中PG、PE和EXP的表达，但促进了XTH和β-Gal的表达。 植物激素，如乙烯、细胞分裂素、JA、IAA和ABA，是调控果实生长和成熟的重要信号分子。果实成熟主要受乙烯的调控，而果实成熟的调控则受多种激素的调节。在草莓中，IAA和ABA被认为在果实成熟过程中起重要作用。本研究检测了IAA、细胞分裂素、GA、BR、JA、乙烯、SA和ABA。精氨酸处理不仅抑制草莓果实着色，而且抑制了果实成熟相关激素JA、ABA和乙烯的代谢。 在草莓中，花青素和类胡萝卜素是调节果实品质和提高果实成熟过程中营养价值的重要色素。花青素是水果和其他器官中重要的次生代谢物，在植物抗逆性中发挥重要作用。在草莓中，花青素在白色阶段的积累伴随着与花青素合成相关的基因表达和酶活性的广泛变化。本研究发现，精氨酸处理组的花青素含量低于对照组，说明精氨酸在草莓果实花青素生物合成中起着重要作用。在转录组分析中，苯丙氨酸解氨酶1（PAL1）、4CL1、LAR、DFR、UFGT和phytoene合成酶（PSY）在Arg处理后均下调。外源精氨酸通过抑制相关基因的表达来控制果实着色，最终延缓草莓果实的成熟。 蔗糖是光合作用的同化产物，为果实的生长发育提供物质基础。近年来，大量研究表明蔗糖可以作为一种信号分子来调节葡萄、西红柿和草莓等水果的成熟。草莓的蔗糖含量在果实生长发育过程中逐渐增加。在本研究中，蔗糖合成关键酶SS和SPS活性上调，促进了Arg处理后蔗糖含量的增加。这表明外源精氨酸处理抑制了草莓采后蔗糖含量的下降，最终延缓了草莓果实的成熟过程。 热休克蛋白是一种应激蛋白，具有普遍的抗应激作用，随着外界环境的变化而急剧增加。热休克蛋白在高温、干旱、过氧化和重金属等胁迫下大量表达。它们主要通过参与蛋白质合成、折叠、细胞定位和蛋白质降解等多种生物学功能来维持植物内部环境的稳定。精氨酸处理提高了HSPs的活性，包括高分子量HSPs和sHSPs。对高分子量HSPs的研究表明，它们不仅参与植物的生长发育，而且介导植物的抗性反应过程。这说明精氨酸促进了HSPs的表达，增强了草莓果实的抗逆性。 结论 本研究鉴定了对草莓果实对Arg处理和对照组之间的DEG，并对外源Arg对草莓成熟的影响进行了全面描述。从色泽和硬度来看，外源Arg显著延缓果实成熟进程。促进草莓IAA积累和抑制花青素合成是导致外源Arg延缓果实成熟的主要因素。RNA-Seq分析表明，外源Arg抑制果实成熟的作用是通过调控果实中相关基因的表达来实现的。此外，研究者还观察到Arg处理下调了一组与TFs有关的基因，如bHLH、ERF、MYB和WRKY。此外，外源Arg还可以促进抗逆性蛋白质和抗氧化酶的合成，从而提高果实的抗逆性。本研究为Arg处理下果实成熟调控提供了新的理论依据和参考。 更多推荐 1 科研 | J AGR FOOD CHEM：葡萄果实发育成熟过程中根系限制对酚类代谢产物影响的转录学分析（国人佳作）
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