【原】科研│J AGR FOOD CHEM（一区）：代谢组和转录组联合分析解析突变体“胎里红”枣果皮花青素合成机制（国人佳作）

转录组 2021-04-20

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编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。

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导读

“胎里红”红枣果皮紫红色主要是花青素积累所致，但目前对红枣果实花青素生物合成机制的研究较少。本研究对枣果不同发育阶段的果皮进行了代谢组和转录组分析，共鉴定出158种黄酮类化合物，其中花青苷-3-O-芦丁糖苷和芍药苷-3，5-O-二葡萄糖苷是主要的花青素。在果实发育和成熟过程中，花青素含量与ZjANS和ZjUGT79B1的表达密切相关，表明这两个基因是花青素生物合成过程中的关键基因。转录组分析表明，转录因子ZjMYB5、ZjTT8和ZjWDR3调控枣果果皮花青素的生物合成。亚细胞定位实验证实ZjANS和ZjUGT79B1定位于细胞核和内质网。ZjMYB5和ZjTT8仅在细胞核中表达，而ZjWDR3则在胞核和胞浆中观察到较强的荧光信号。原核表达和体外酶活性测定表明，重组ZjANS蛋白催化(+)-儿茶素合成花青素。ZjUFGT79B1修饰的花青素-3-O-葡萄糖苷进行二次糖基化得到花青素-3-O-芦丁糖苷，ZjCCoAOMT易催化由花青素-3，5-O-葡萄糖苷合成甲基化花青素芍药苷-3，5-O-二葡萄糖苷。双荧光素酶和GUS活性测定表明，ZjMYB5、ZjTT8和ZjWDR3均能激活ZjANS和ZjUGT79B1启动子。以上结果表明，这三种转录因子在颜色突变体大枣花青素的生物合成过程中起着重要作用。“胎里红”通过增强ZjANS和ZjUGT79B1的表达促进花色苷的积累。

论文ID

原名：Metabolomic and Transcriptomic Analyses of Anthocyanin Biosynthesis Mechanisms in the Color Mutant Ziziphus jujuba cv. Tailihong

译名：代谢组和转录组联合分析解析突变体“胎里红”枣果皮花青素合成机制

期刊：Journal of agriculture and food chemistry

IF：4.192

发表时间：2020年12月

通讯作者：李新岗

通讯作者单位：西北农林科技大学

DOI号：10.1021/acs.jafc.0c05334

实验设计

结果

1 不同发育阶段红枣果皮代谢组的研究

枣果发育过程中总花青素和类黄酮含量显著下降，枣果发育过程中总花青素和类黄酮含量显著下降（图1）。代谢产物分析共鉴定出157种黄酮类化合物，包括12种花青素、42种黄酮、22种黄酮醇、9种黄烷醇、15种黄烷酮、8种原花青素和19种苯丙类化合物。

根据阈值|log2(fold change)|≥1和VIP≥1筛选差异代谢物（DFM）。分析DAP90和DAP30检测到51个DFM，包括个花青素、13个黄酮、7个黄酮和9个苯丙烷类化合物（图2A）。DAP110和DAP90之间有55个DFM，包括3个花青素，11个黄酮，12个黄酮醇和5个黄烷酮（图2B）。DAP110和DAP30之间有52个DFM。所有DFM中，大部分花青素、黄酮和黄酮醇在DAP30时显著高于DAP110时，包括芍药苷、花青素、木樨苷和芹菜素衍生物（图2C）。图2D展示了不同差异分组的共有和特有DFM。

花青素是一种水溶性色素，对“胎里红”果皮的着色起着重要作用。在“胎里红”果实发育过程中，检测到12种不同的花青素。其中以矢车菊色素、芍药色素、飞燕草色素和牵牛花色素糖苷含量最多。“胎里红”幼果期枣皮紫红色主要来源矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芍药色素-3,5-O-二葡萄糖苷和矢车菊素，这些代谢物的含量在DAP30时的含量显著高于DAP110。随着果实成熟，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷含量下降。因此，推测“胎里红”幼果时期枣果皮中高含量的矢车菊素和芍药色素衍生物是其呈红紫色的原因。

图1.胎里红不同发育阶段的总花青素和总黄酮含量变化。

图2.胎里红果皮不同发育阶段的差异代谢物。A-C DAP90与DAP30、DAP110与DAP90以及DAP110与DAP30比较中的DFM热图。D 不同差异分组中DFM的韦恩图。

2 枣树果皮发育过程中的转录分析

为了进一步探索红枣果皮中花青素合成的分子机制，构建了3个不同发育阶段的9个cDNA文库的进行转录组分析。三个比较组(DAP90 vs DAP30、DAP110 vs DAP90、DAP110 vs DAP30)分别有3927、2553、5722个基因上调表达，4431、3647、6527个基因下调表达（图3A）。使用GO注释分析从生物过程、细胞成分和分子功能类对DEG进行注释。对DEG进行KEGG途径富集分析，发现DEG在多个代谢途径中富集，包括二级代谢途径、类黄酮代谢途径、代谢途径和脂肪酸代谢途径（图3B）。

图3.“胎里红”不同发育阶段差异基因的KEGG富集分析。A不同差异分组中上调和下调的DEG数。B 不同差异分组中DEG的前20条KEGG途径。

3 与花青素生物合成相关的DEG

颜色突变品种“胎里红”果实幼时紫红色，早熟呈黄色，成熟时呈红色（图5A）。因此，本研究使用不同发育阶段果皮的转录数据来探索花青素生物合成的变化。本研究关注花青素生物合成途径的结构基因的表达，以及已知调节其他物种花青素生物合成的转录因子家族(MYB、bHLH和WD40)的表达。ZjANS的表达量在DAP30比DAP110表达量高219.96倍，这与青枣果皮中花青素含量高的结果一致。代谢组学分析表明，红枣果皮中的主要花青素成分为花青苷-3-O-芦丁糖苷和芍药苷-3，5-O-二葡萄糖苷。花青苷-3-O-芦丁糖苷是糖基化反应的产物，芍药苷-3，5-O-二葡萄糖苷是甲基化反应的产物。因此，编码糖基转移酶和甲基转移酶的基因可能参与了花青素的生物合成。转录组数据中编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶基因的ZjUGT79B1在DAP30的表达量高于DAP110。而甲基转移酶基因ZjCCoAOMT的表达随着成熟度的增加而增加，表明它可能参与了其他黄酮类化合物的甲基化。还鉴定到调控花青苷合成相关的转录因子ZjMYB5、ZjMYB113、ZjTT8、ZjGL3b、ZjGL3a、ZjWDR1、ZjWDR2和ZjWDR3（图4）。

图4.红枣果实发育过程中类黄酮生物合成途径中的DEG表达谱。

4 花青素合成相关候选基因表达模式

利用qRT-PCR分析了“胎里红”果皮不同组织和不同发育阶段花青素含量与相关候选基因的表达情况（图5A）。花青素含量在DAP30时最高，随着果实发育逐渐下降。在茎、幼果和幼叶中含量较高，但在花瓣中含量较低，在较老叶片中几乎检测不到（图5B）。

ZjANS和ZjUG79B1在茎、幼叶和幼果中的表达水平较高。相反，ZjCCoAOMT在花青素含量很低的老叶中高表达。ZjANS和ZjUG79B1的表达在枣果发育过程中呈下降趋势，而ZjCCoAOMT的表达在DAP50达到高峰，之后逐渐下降。相关分析表明，枣果果皮花青素含量与ZjANS和ZjUGT79B1的表达呈正相关。花青素甲基化基因ZjCCoAOMT的表达与花青素含量呈弱相关。说明ZjANS和ZjUGT79B1在枣皮花青素的生物合成中起重要作用，而ZjCCoAOMT负责催化花青素甲基化（图5C-E）。

转录因子基因ZjMYB5、ZjGL3a、ZjTT8和ZjWDR3在茎、幼叶和幼果果皮中高表达，这些组织花青素含量均比较高。它们在老叶中的表达量较低，老叶中花青素含量也较低。ZjWDR1在茎和幼叶中高表达，其次是花中表达量也比较高。ZjMYB113、ZjGL3a和ZjWDR2在老叶中的表达高于幼果。ZjMYB5、ZjGL3a和ZjTT8的表达水平在果实发育过程中呈下降趋势，而ZjMYB113和ZjWDR2的表达水平则是先下降后略有上升。ZjWDR1的表达在整个果实发育过程中相对稳定，而ZjWDR3的表达在果实发育早期增加，在DAP80达到高峰后急剧下降。相关分析表明，ZjMYB5、ZjGL3a、ZjTT8和ZjWDR3的表达水平与花青素含量高度相关。ZjMYB113、ZjGL3b和ZjWDR2在发育过程中均有表达，但它们的表达水平与花青素合成无关。研究人员推测它们对“胎里红”枣果皮花青素的生物合成并不重要，因此没有选择它们进行进一步的功能分析（图5F-M）。

图5.不同组织花青素含量及相关基因表达谱。A“胎里红”不同组织和果实发育阶段表型。B “胎里红”红枣果皮总花色苷含量。C-M不同组织和果实发育阶段候选基因的qRT-PCR分析。

5 重组蛋白ZjANS、ZjUGT79B1、ZjCCoAOMT的体外鉴定

通过SDS-PAGE检测蛋白，显示出特定的条带，并且随着时间的推移蛋白质显著富集（图6A）。诱导蛋白的大小接近预测的蛋白分子量。如图6B，C所示，两种重组蛋白分别催化原花青素和花青素-3-O-葡萄糖苷生成花青素和花青素-3-O-葡萄糖苷。同样还检测ZjCCoAOMT基因的胞外酶活性，以证实ZjCCoAOMT基因的功能。SDS-PAGE和Western blot分析表明，该蛋白的大小与预测的分子量一致。

图6. ZjANS和ZjUGT79B1的原核表达及活性测定。A PET-22b(+)-ZjANS和pGEX-61-ZjUGT79B1在大肠杆菌中的表达。B ZjANS对两种花青素活性的高效液相色谱分析。C 花青素物质之间的转化。

6 亚细胞定位分析

研究人员构建了ZjANSGFP、ZjUGT79B1-GFP、ZjMYB5-GFP、ZjTT8-GFP和ZjWDR3-GFP融合蛋白，并将它们瞬时转化到本氏烟草表皮细胞中，构建了ZjANSGFP、ZjUGT79B1-GFP和ZjMYB5-GFP融合蛋白。亚细胞定位结果说明ZjANS和ZjUGT79B1不仅定位在细胞核上也分布在内质网中（图7）。ZjMYB5-GFP和ZjTT8-GFP定位于胞核，ZjWDR3-GFP荧光信号在胞核和胞浆均较强。

图7. ZjANS和ZjUGT79B1在本氏烟草中的亚细胞定位。

7 ZjMYB5、ZjTT8、ZjWDR3对ZjANS、ZjUGT79B1启动子的调控

为了确定ZjMYB5、ZjTT8和ZjWDR3是否调控ZjANS和ZjUGT79B1，研究人员克隆了这两个花青素基因的启动子序列，分析其启动子内的顺式作用元件。ZjANS和ZjUGT79B1启动子包含MYB相互作用位点MBS和bHLH相互作用位点G-box和Box-415。因此，研究人员推测这三个转录因子通过与ZjANS和ZjUGT79B1的启动子结合来激活ZjANS和ZjUGT79B1的转录。

研究人员通过组织化学染色和定量蛋白活性分析以期验证这一假设。单独注射ZjMYB5使报告基因ZjANSpro：GUS和ZjUGT79B1pro：GUS的表达分别增加2.32倍和3.66倍。此外，当ZjMYB5与ZjTT8共转化时，ZjANSpro：GUS和ZjUGT79B1pro：GUS的转录增强，ZjWDR3的加入进一步促进了这种增强（图8B）。叶片中GUS染色的程度与GUS蛋白的活性模式是一致的（图8A）。使用相同的瞬时表达系统，不同的效应子组合，包括仅ZjMYB5、ZjMYB5+ZjTT8、ZjMYB5+ZjTT8+ZjWR3，都能激活ZjANSpro：荧光素酶报告实验(LUC)和ZjUGT79B1pro：LUC（图8C，D）。因此，ZjMYB5对“胎里红”果皮发育过程中花青素的生物合成具有正向调节作用。