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编译：寒江雪，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 枣叶具有很高的营养价值和药用价值。然而，对枣叶中的代谢物缺乏全面的动态的评估。本研究采用超高效液相色谱/串联质谱联用技术，对紫色叶芽和绿色成熟叶的初级和次级代谢产物进行了研究。共鉴定了778种代谢物，其中700多种化合物均为首次报道。差异积累代谢物分析表明，黄酮类化合物是主要的差异代谢物，并决定了叶片的色泽。转录组数据表明，20个类黄酮结构基因和3种主要类型的类黄酮调控基因存在显著差异表达。此外，光照对黄酮类化合物的积累有显著影响。这些结果加深了对枣叶代谢产物积累和类黄酮生物合成分子机制的理解。 论文ID 原名：Metabolic and transcriptomic analyses reveal different metabolite biosynthesis profiles between leaf buds and mature leaves in Ziziphus jujuba mill 译名：代谢和转录组联合分析枣树叶芽和成熟叶间代谢产物动态变化 期刊：Food Chemistry IF：6.306 发表时间：2021年1月 通讯作者：赵旭升 通讯作者单位：洛阳师范学院生命科学学院 DOI号：10.1016/j.foodchem.2021.129005 实验设计 结果 1 基于UPLC-MS/MS的枣叶代谢组学定量分析 为了更好地了解叶片颜色变化过程中相关代谢产物的动态变化，采用UPLC-MS/MS分析方法，从'三边红’和'胎里红’叶片中鉴定了初级和次生代谢产物。通过聚类分析和相关分析，12个样本被分为四组（图2A），组内样本显示出显著的相关性，主成分分析也显示出LS1、LS2、LT1和LT2之间的明显分离（图2B）。 如图2C所示，共鉴定了778种代谢物，可归为18类，其中大部分代谢物可归为6类，分别为黄酮(23.14%)、有机酸及其衍生物(14.52%)、氨基酸及其衍生物(11.70%)、脂类(8.35%)、苯丙类(8.23%)、核苷酸及其衍生物(6.68%)。LS1、LS2、LT1和LT2中分别检测到732、690、729和708种代谢物（图2D）。总体而言，叶芽和成熟叶具有不同的代谢产物谱。
图2.叶芽(LS1和LT1)和成熟叶(LS2和LT2)代谢组学数据的定性和定量分析。A 已鉴定代谢物的热图。B 叶芽和成熟叶的主成分分析。C 枣叶中已鉴定代谢物的成分分析。D LS1、LS2、LT1和LT2代谢物的维恩图。 2 叶芽与成熟叶之间的代谢变化 在LS1和LS2之间共检测到313个差异积累代谢物（DAM），其中LS1中有205个上调的代谢物和108个下调的代谢物。在LT1和LT2之间有316个DAM，分别有211和105个DAM在LT1上调和下调（图3）。 表1展示了不同样本的DAM。LS2和LS1中的DAM可分为14类，其中大部分DAM可分为5类，包括类黄酮(25.56%)、有机酸及其衍生物(13.74%)、氨基酸及其衍生物(12.46%)、苯丙烷(7.99%)、核苷酸及其衍生物(7.03%)。LT2和LT1中的DAM的分类也可如上分类，黄酮类(26.27%)、有机酸及其衍生物(12.03%)、氨基酸及其衍生物(11.08%)、苯丙烷类(9.81%)、脂类(9.49%)、核苷酸及其衍生物(8.54%)所占比例较大。多重对比分析表明，超过一半的DAM(194个代谢物)同时在两个品种中同时检测到（图3C）。 DAM也可被分为两组，第一组主要是抗氧化成分，包括黄酮、生物碱、萜类、维生素及其衍生物、酚酰胺、多酚和甾体，多数抗氧化成分在叶芽中的含量高于成熟叶中。第二组DAM由风味成分构成，包括有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物以及碳水化合物。叶芽中氨基酸及其衍生物和碳水化合物的主要含量显著大于成熟叶片。相反，两个紫叶品种的有机酸及其衍生物DAM的变化趋势并不一致。 综上所述，本研究结果表明，'三边红’和'胎里红’代谢物积累模式相似。在枣叶发育过程中，约有40%的代谢产物表现出明显的差异，其中黄酮类化合物是主要的差异代谢物。 表1.“三边红”和“胎里红”差异积累代谢物的统计。 3 叶色变化背后的色素积累 为了阐明色素生物合成对叶色变化的机理，本研究测定了两个紫叶品种和一个绿叶品种的色素含量。紫叶和绿叶品种的叶绿素和类胡萝卜素含量表现出相似的积累规律，随着叶片发育，叶绿素和类胡萝卜素含量急剧增加。（图4A和B）。两个紫叶品种花色苷含量在成熟过程中显著下降。与之相反，绿叶品种花色苷含量显著增加（图4C）。因此，研究结果表明，花色苷是决定叶色变化的主要因素。 为了进一步检测花色苷的类型，将花色苷与代谢物数据库进行了比较。花青素O-丁香酸和芹菜素在叶芽中含量较高，其他花色苷在叶片发育过程中保持稳定水平（图4D）。而飞雀素3-O-葡萄糖苷、白藜芦素、芍药苷和花青素3-O-葡萄糖苷，随着叶片的发育而增加。本研究结果表明花青素、O-丁香酸和芹菜素在两个紫叶品种的叶芽着色中起着关键作用（图4E）。 图4.紫叶芽和绿色成熟叶的色素分析。A 总叶绿素含量。B 总类胡萝卜素含量。C 总花色苷含量。D 花青素含量热图。E LS2与LS1和LT2与LT1中差异积累花青素韦恩图。 4 类黄酮结构和调控基因的差异表达 为了研究叶芽和成熟叶之间的基因表达谱，LS1、LS2、LT1和LT2中构建了4个cDNA文库,对12个样本进行mRNA测序，共获得56.3 GB的clean data，每个样本至少4.1 GB的clean data。将clean data映射到枣树基因组上，比对率在82.24%到92.44%之间。在LS1和LS2之间共检测到9,534个差异表达基因（DEG），其中LS1中有5,181个上调基因和4,353个下调基因。与LT2相比，LT1中有3645个基因表达上调，2516个基因表达下调。 根据代谢组学分析结果，红枣叶中的主要代谢物是黄酮类化合物，并决定了红枣叶的色泽。因此，本研究重点研究了黄酮类化合物的生物合成。在'三边红’中，检测到20个在LS1和LS2之间差异表达的类黄酮结构基因，并且这些基因都随着叶片的发育而减少（图5）。同样，在'胎里红’成熟过程中，19个黄酮类结构基因的表达量也明显下降。此外，研究人员还发现在'三边红’和'胎里红’中差异表达的类黄酮结构基因大部分都有重叠。 在LS1和LS2之间差异表达的类黄酮调控基因共检测到170个。在LS1中有95个基因表达上调，包括R2R3-MYB基因52个，bHLH基因25个，WD40基因18个。75个基因表达下调，包括49个R2R3-MYB基因， 12个bHLH基因，14个WD40基因。在LT1和LT2之间检测到37个差异表达的类黄酮调控基因。其中有27个基因表达上调，仅有2个R2R3-MYB基因、3个bHLH基因和1个WD40基因在LT1中表达下调。在两个品种中同时检测到27个上调基因和5个下调基因。 为了验证转录组分析结果的准确性和重复性，随机选取10个类黄酮结构基因和5个类黄酮调控基因进行qRT-PCR验证。15个基因的qRT-PCR与与RNA-Seq数据相同的表达趋势。这些结果证实了RNA-Seq数据的可靠性。 图5.枣叶中黄酮类化合物的生物合成途径。 5 光照对叶芽中黄酮类化合物积累的影响 为了研究光照对枣叶类黄酮积累的影响，在光照和黑暗条件下对两个紫叶品种的叶芽进行了培养。黑暗条件下的叶芽呈绿色（图6A），与光照处理的叶芽相比，暗处理的叶芽中总黄酮和总花色苷的含量显著降低（图6B和C）。本研究进一步分析类黄酮结构基因的表达水平，发现大多数基因在暗处理的叶芽中比在光处理的叶芽中显着下调（图6D-M）。综上所述，这些结果表明枣叶中的黄酮类化合物是以光依赖的方式积累的。 图6.暗处理(LS1-D和LT1-D)和光处理(LS1-L和LT1-L)下叶芽中黄酮类化合物的积累。A叶芽的表型。B总黄酮含量。C总花色苷含量。D-M类黄酮结构基因的表达分析。 讨论 本研究对枣叶的初级和次生代谢物进行了综合分析，首次报道了700多种化合物。枣叶中的主要成分为黄酮类化合物、有机酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、脂类、苯丙类、核苷酸及其衍生物。以往研究中检测到的生物活性物质种类的局限性限制了研究人员对枣叶化学成分的了解，因此本研究结果对枣叶的化学成分有重要的阐明作用。 黄酮类化合物是枣叶中的主要抗氧化成分。本研究在枣叶中检测到120多个新的黄酮类化合物。DAM分析表明，叶芽比成熟叶含有更多的抗氧化成分。芦丁、槲皮苷和儿茶素是枣叶中的主要黄酮类化合物。芦丁含量在叶片发育过程中差异不显著，而槲皮苷和儿茶素在叶芽中的含量高于成熟叶片。因此，可以从叶芽中提取更多的抗氧化剂。 花色苷具有优异的抗氧化能力。与绿叶品种相比，紫叶品种的叶芽花青素含量较高，但增加的花色苷含量并没有显著提高它们的抗氧化能力。只有少数花色苷在幼叶和成熟叶之间表现出显著差异。因此，研究人员推测花色苷不是影响枣叶抗氧化能力的主要因素。 和叶子的颜色一样，'胎里红’幼果的颜色也是由花青素决定的。'胎里红’幼果色泽与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、飞雀素3-O-葡萄糖苷和3-O-芦丁糖苷的积累有关。但在'胎里红’的叶芽中未检测到花青素矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和花青素3-O-芦丁糖苷，飞雀素3-O-葡萄糖苷含量也较低。冬枣果实与枣叶的花色苷积累模式也不同，因此研究人员认为枣果和枣叶的颜色是由不同的花青素决定的。 在枣果中，bHLH转录因子主要参与调控果实发育早期花色苷的积累。MYB和HD-Zip正向调控果实成熟过程中的类黄酮/花青素生物合成基因。3个转录因子ZjGL3a、ZjGL3b和ZjTT8可能调控枣果花青素的合成。本研究结果表明R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40重复蛋白是枣叶中主要的类黄酮/花青素调控因子。相反，只有两个HD-Zip基因(LOC107420449和LOC107430326)表现出显著差异。此外，研究人员还发现ZjTT8(LOC107426439)在紫叶芽中表达水平较高，说明ZjTT8基因可能是调控枣果和红枣叶片类黄酮/花青素合成的关键基因。 结论 本研究从枣叶中鉴定出778种初级和次级代谢产物，约40%的代谢物在叶芽和成熟叶之间存在显著差异。这些DAM可以分为两类，包括抗氧化成分和风味成分。黄酮类化合物是主要的物质基础，花色苷决定了叶片的颜色，并以光依赖的方式积累。此外，利用RNA-Seq和qRT-PCR进一步分析了黄酮类化合物的生物合成。综上所述，本研究结果提高了人们对枣叶化学成分和药用价值的认识，为枣叶作为功能性食品的开发提供了理论支持。 更多推荐 1 科研│J AGR FOOD CHEM（一区）：代谢物和转录图谱分析揭示了“紫娟”茶树花青素代谢的分子机制（国人佳作） END |
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