|
编译：刘娟，编辑：景行、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 本文采用单细胞RNA-seq，分析非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者肿瘤组织样本，确定肿瘤浸润B细胞亚型及其在NSCLC进展中的多种功能。两组独立流式细胞术和免疫组化实验证实B细胞两种主要亚型（初始B细胞和效应B细胞）的共存。晚期NSCLC中初始B细胞减少，其水平降低与预后不良相关。将NSCLC样本分离的初始B细胞与两种肺癌细胞株共培养，发现初始B细胞分泌四种负调控因子，抑制肺癌细胞的生长。研究者证明效应B细胞在NSCLC早期抑制癌细胞生长，但在晚期NSCLC促进细胞生长。蛋白质组学数据进一步验证效应B细胞产生的免疫球蛋白以及其相互作用蛋白在NSCLC进展中的作用。本研究分析揭示肿瘤浸润B细胞的多种功能及其在NSCLC中的临床意义。 论文ID 原名：Single-cell transcriptome and antigenimmunoglobin analysis reveals the diversity of B cells in non-small cell lung cancer 译名：单细胞转录组和抗原免疫球蛋白分析揭示B细胞在非小细胞肺癌中的多样性 期刊：Genome Biology IF：10.806 发表时间：2020年6月 通讯作者：姜格宁; 张鹏 通讯作者单位：同济大学医学院 DOI号：10.1186/s13059-020-02064-6 实验设计 本研究对11例NSCLC患者的115545个细胞进行单细胞RNA-seq分析，系统研究肿瘤浸润B细胞谱与NSCLC患者临床结局之间的关系，发现两类B细胞在NSCLC的肿瘤微环境中共存。研究者进一步验证这两种B细胞亚型并在两个队列中使用免疫组化和流式细胞术来确定其临床影响。此外，进行功能分析以确定两类B细胞在NSCLC进展中的机制。总之，本研究研究获得高质量的I-III期NSCLC肿瘤微环境的单细胞转录组谱，也探索B细胞在NSCLC中的作用机制和潜在治疗前景。 结果 1非小细胞肺癌中免疫细胞的浸润 为系统研究非小细胞肺癌的肿瘤微环境，研究者使用术后立即收集的新鲜肿瘤样本进行单细胞RNA-seq分析，共11例NSCLC患者的肿瘤组织（包括6例阶段I和5例阶段III）, 单细胞RNA-seq分析115545个细胞(图1a),同时用Ficoll梯度离心机去除红细胞,血小板和死细胞。将收集到的不同样本单细胞转录组图谱合并，UMAP细胞聚类分析，使用已知的细胞类型特异性基因标记进一步注释细胞类型。总共发现和注释22个不同细胞簇，包括T细胞、B细胞、单核细胞、肿瘤和表皮细胞的亚型(图1b)。 研究者发现6类T细胞(C0, C1, C3, C11, C13, C21)(图1b)：C0和C11簇T细胞CD3E、CD8A、CD8B高表达，提示其为CD8+T细胞；C13簇T细胞表达高水平的NCAM1 (CD56)、CD3E和NKG7，低水平的CD8A和CD8B，提示其可能是自然杀伤T细胞(NKT)；C1簇T细胞表达CD3E和CD69基因，提示其为CD69+T细胞；C21表达高水平的CD4和GZMB，提示其为CD4+CTLs；C3簇高表达FOXP3和IL2RA (CD25)，这可能是Tregs。研究者也发现两类B细胞(C4, C6)，分别表达CD79A (C4和C6)和MS4A1 (CD20) (C4)。研究者发现5类肿瘤细胞(C8、C9、C10、C18、C20)，均表达肿瘤细胞标记基因EPCAM、CEACAM6或MKI67。还发现5类表达CD14和CD86的单核细胞(C2、C5、C7、C12、C14)。C2、C5、C7、C14高水平表达CD163和MRC1 (CD206)，表明肿瘤微环境中单核/巨噬细胞以M2极化巨噬细胞为主。在scRNA-seq中，还观察到红细胞(C19)表达HBA1和HBB,表皮或血管细胞(C15和C17)表达COL3A1和COL1A2 (C15)或IGFBP7 (C17)以及肥大细胞(C16)表达TPSAB1和TPSB2 (图1 c)。接下来，检测不同患者22种细胞的比例，在11个肿瘤样本中，每种细胞类型的组成有很大的不同(图1d)。 为确定这些细胞类型对NSCLC的临床影响，通过ROC分析选择最能确定每种细胞类型的前20个基因。通过TCGA数据中的多变量Cox回归进一步计算这些基因表达水平与NSCLC预后之间的相关性。发现这些基因只在C10(肿瘤细胞)中表达(ave.cor =0.178)与不良预后相关(图1e)，其中ave.cor表示平均皮尔逊相关系数。另一方面，表达CD69+T细胞的C1 (ave.cor=−0.164)和表达B细胞的C4(ave.cor=−0.174)与NSCLC的良好预后相关，提示这些细胞可能具有肿瘤抑制功能。值得注意的是，高表达的基因完全表达C4 B细胞类型,如MS4A1(也称为CD20抗原)与NSCLC预后良好呈正相关 (图1e,f),表明C4细胞在NSCLC微环境中具有抑癌作用。根据其与预后的显著相关性，进一步探究NSCLC肿瘤微环境中B细胞亚型及其生物学特性。 图1.单细胞转录组分析揭示肺癌微环境中细胞转录组。a.本研究的实验设计示意图。b.用UMAP软件对115545个新鲜分离的原发性肺癌细胞的单细胞RNA-seq数据进行可视化。c.22种亚类细胞中的基因表达。d.22种亚类在11例NSCLC患者中的分布。e.22种亚类细胞中每个亚类细胞特有表达基因的预后价值。 2 NSCLC中多种B细胞亚型共存 为发现NSCLC中B细胞的特点，将NSCLC scRNA-seq分析的C4和C6细胞保留以开展下一步实验。还从10X基因组产生的外周血单核细胞(PBMCs)中提取正常单细胞数据集，将NSCLC和血液中B细胞的单细胞RNA-seq数据结合(图2a)。B细胞主要分为BC1和BC2两大类。PBMCs中含有91.8%的BC1细胞和8.2%的BC2细胞，而NSCLC样本中含有61.8%的BC1细胞和39.2%的BC2细胞(图2b)。BC1细胞表达初始B细胞的标记，如MS4A1（CD20）, CD19, CD22, TCL1A, CD83以及BC2细胞表达效应B细胞的标记,如CD38、TNFRSF17 (BCMA)和IGHG1/IGHG4(图2c,d)。进一步研究两个B细胞亚型的分布在NSCLC的不同阶段,分析I期和III期NSCLC中这两种细胞类型的百分比发现，与I期相比，初始B细胞在III期显著降低(t检验P<0.001)(图2e)。 研究者进一步检测BC1(初始B)细胞在PBMC和NSCLC肿瘤微环境中的差异表达基因，ROC分析共发现73个差异表达基因(图2f)。NSCLC中的BC1细胞过度表达RACK1、JUND、CD83、ELOB、NFKB1A、APOE和GADD45B，而PBMC中的BC1细胞过度表达GNB2L1、GLTSCR2、NBEAL1、ALDOA和TCEB2(图2f)。接下来，使用CellPhoneDB算法分析细胞-细胞相互作用并确定两种细胞类型(和其他细胞类型)之间的细胞-细胞相互作用网络。值得注意的是，B细胞表达的基因与其他免疫细胞类型表现出很强的相互作用，提示B细胞在NSCLC微环境中发挥重要作用。 图2.NSCLC肿瘤微环境中两种主要B细胞亚型。a.示意图。b.UMAP显示B细胞的单细胞RNA-seq数据。c.不同类型B细胞间有代表性的基因表达。d.MS4A1 (CD20)、CD22、CD19、TNFRSF17(BCMA)、IGHG1、IGHG4在B细胞中的表达。e.Ⅲ期NSCLC中B细胞不同亚类的分布。f.热图显示NSCLC与PBMC之间BC1（初始B细胞)差异。 3 初始 B细胞与NSCLC的良好预后相关 为验证不同B细胞在NSCLC微环境中共存并确定不同B细胞亚型的临床相关性，采用免疫组化和免疫荧光技术对原发性NSCLC组织中CD79A和CD20进行共染。如图3a所示，有一部分细胞同时表达CD79A和CD20，而其余细胞只表达CD79A。注意到CD20阳性细胞主要位于肺肿瘤三级淋巴结构 (TLS),而CD79A阳性细胞不仅位于TLS也随机富集在肿瘤组织(图3B),提示CD20+初始B细胞和效应B细胞可能在肺癌具有功能。研究者进一步对30个NSCLC肿瘤组织进行流式细胞术分析（包括10个I期、10个II期和10个III期新鲜组织），显示两种B细胞亚型共存(图3c)。此外，还观察到晚期NSCLC中CD20+CD79+B细胞减少(图3d)。 为证实这一观察结果，研究者在一个164例NSCLC样本的队列中分析初始B细胞浸润的临床影响。用CD20和CD79A抗体对164例NSCLC样本进行染色，并利用CD20+CD79A+阳性细胞在TILs中的比例来评估初始B细胞的浸润水平。发现与NSCLC I期相比，NSCLC II期(t检验P = 0.01)和III期(t检验P<0.001)中初始细胞的浸润水平明显降低(图3e)。进一步根据肿瘤组织中CD20+CD79A+细胞的浸润程度，将NSCLC样本分为初始Bhigh组和初始Blow组，比较两组患者的预后，发现初始B的浸润水平越高，总生存率(log-rank检验P<0.01)和无复发生存率(log-rank检验P=0.02)越好(图3f)。 利用LUAD TCGA队列的转录组数据，进一步检测两种B细胞亚型特异性标记基因在肺癌不同分期中的表达水平，与邻近正常组织相比，肿瘤组织中MS4A1 (CD20)的表达水平更高(图3g)，在肺癌晚期MS4A1的表达水平显著降低(图3g)。由于PD-1/PD-L1抑制剂的结果主要依赖于PD-1/PD-L1的表达水平和肿瘤突变负荷(TMB)，我们在TCGA队列中检测B细胞浸润与PD-1/PD-L1表达和TMB的关系。B细胞浸润水平越高，PD-1/PD-L1表达水平越高，TMB表达水平越高(图3h,i)，暗示高水平的B细胞浸润可能有利于抗PD-1/PD-L1的免疫治疗。 图3.CD20+B细胞与NSCLC良好预后相关。a,b验证CD79A+CD20+和CD79A+CD20-B细胞在NSCLC肿瘤中的存在,CD79A(红色),CD20(绿色)。b.免疫组化显示CD79A和CD20在NSCLC组织中的分布。c, d流式细胞术显示晚期NSCLC中CD79A+CD20+细胞减少。c.流式细胞术数据的代表性图表。d.30例NSCLC的I-III期肿瘤组织中CD79A+CD20+和CD79A+CD20-的比例。e,f患者高水平初始B细胞浸润与NSCLC的临床结果相关性。e.I-III期NSCLC免疫组化检测初始B细胞。f.在164例NSCLC患者中，初始B细胞富集与预后良好相关。g.TCGA数据集验证。h,i.MS4A1(CD20)表达与PDCD1 (PD-1)/CD274 (PD-L1)以及LUAD肿瘤突变负荷的相关性。 4 初始B细胞抑制NSCLC细胞增殖 为评估初始B细胞对肿瘤细胞的直接影响，研究者采用抗CD20抗体的流式细胞仪分选，在NSCLC组织中获得初始B细胞。对8例新鲜NSCLC肿瘤组织中的初始B细胞进行分类，其中4个为I期，4个为III期。然后将初始B细胞与肺癌细胞系A549、H1299共培养,24h检测A549和H1299细胞与CD20+B细胞共培养后的细胞活力,与CD20+B细胞共培养显著抑制A549和H1299细胞的生长(P<0.001)(图4a)。 免疫细胞对肿瘤细胞的作用既可以通过直接的细胞-细胞相互作用，也可以通过可溶性介质如因子和细胞因子来实现。研究者从NSCLC组织中提取CD20+B细胞的培养上清液，用其处理A549和H1299细胞24h，发现CD20+B细胞的培养上清液抑制A549和H1299细胞的生长(图4B)，表明CD20+B细胞对肺癌细胞的影响可以独立于细胞间的相互作用，提示CD20+B细胞分泌的蛋白可能有助NSCLC中CD20+B细胞的抑瘤功能。 为进一步确定B细胞分泌的哪些因子参与肿瘤细胞的调控，研究者首先分析CD20+B细胞中大量表达的基因，在CD20+B细胞中发现1426个高表达基因，66个特异表达基因(图4c)。然后在Uniprot数据库中获得人分泌蛋白，并将CD20+B细胞中的高表达基因与注释的分泌蛋白重叠。四种分泌蛋白在CD20+B细胞中特异表达，包括VNN2 (Vanin 2)、IFI30 (γ-干扰素诱导蛋白IP-30)、PIK3AP1 (B细胞适配器蛋白)和SERPINA9 (Serpin家族A成员9)(图4c)。接下来，为确认CD20+B细胞是否分泌SERPINA9和VNN2，研究者检测细胞培养液中SERPINA9和VNN2的蛋白水平，发现SERPINA9和VNN2富集(图4d)，表明NSCLC中CD20+B细胞分泌这些蛋白。 接下来，研究者试图确定这四种蛋白质对肿瘤细胞的影响。由于这四种蛋白质的商业化蛋白质有限，无法检测这四种蛋白质对肿瘤细胞的直接作用。因此，在A549和H1299肺癌细胞系中过表达这些基因，以测试这些蛋白对NSCLC细胞的影响，发现过表达SERPINA9和VNN2抑制A549和H1299细胞的生长(图4e)。 5 晚期NSCLC中效应B细胞促进肿瘤细胞增殖，早期NSCLC中效应B细胞部分抑制肿瘤细胞增殖 为进一步明确效应B细胞在NSCC肿瘤进展中的作用,研究者用BCMA抗体从3个I期肿瘤组织和3个III期肿瘤组织中筛选出效应B细胞。然后将效应B细胞与A549和H1299细胞共培养，发现III期效应B细胞促进细胞增殖而I期效应B细胞抑制A549和H1299细胞增殖 (图5),表明效应B细胞在Ⅲ期NSCLC中具有促瘤作用，在Ⅰ期NSCLC中具有抑瘤作用。 为检测这些效应B细胞的作用是依赖于直接的细胞-细胞相互作用还是通过分泌的分子，研究者收集从Ⅰ期或III期NSCLC中分离的效应B细胞上清液培养，然后处理A549和H1299细胞，发现I期血浆样B细胞培养上清抑制A549和H1299细胞的生长，而III期血浆样B细胞培养上清促进A549细胞的生长和H1299细胞的生长(图5b)，表明效应B细胞的作用可以归因于其分泌的分子。 scRNA-seq分析显示IGHG1、IGHG4基因(编码IgG蛋白)在效应B细胞中高水平表达(图2d)。接下来，检测这些效应B细胞培养液中IgG和IgA的表达并观察到非常高水平的IgG(图5c)。为确定IgG的功能，研究者从不同阶段的NSCLC中分离出IgG(图5d)，用这些IgG处理A549,发现I期NSCLC IgG对A549细胞毒性较小，而III期NSCLC IgG明显促进A549细胞的生长(图5e)。综上所述，效应B细胞在不同NSCLC分期对肿瘤细胞的作用可能存在差异，其作用主要与分泌的IgGs有关。 6 病理免疫球蛋白靶点的鉴定 为揭示效应B细胞产生这些IgGs的功能，进一步确定IgGs在癌细胞中的作用靶点。研究者使用效应B细胞产生的内源性IgG对8例NSCLC组织中进行免疫沉淀，包括4个I期NSCLC和4个III期NSCLC。首先对肿瘤样本进行细胞裂解，其中含IgGs和这些IgGs的靶蛋白，利用磁蛋白A/G珠沉淀这些IgGs及其靶蛋白。然后将沉淀的蛋白质进行蛋白质组学分析(图6a)，共发现637个蛋白质。这些蛋白可以分为三组:IgG蛋白、IgG结合蛋白和IgGs靶蛋白(图6b)。Western Blot进一步验证LC-MS/MS(图6c)。IgG蛋白直接被蛋白A/G珠捕获，包括IGHG和IGHL。IgG结合蛋白是与IgG直接相互作用的蛋白，主要是fc结合蛋白。这些蛋白通过IgG的Fc域与IgG结合，并触发下游的生物事件。接下来，我们分析这些Fc结合蛋白在不同细胞类型中的表达，发现Fc结合蛋白主要由单核细胞或巨噬细胞表达，如C1QA、C1QB、C1QC、FCGR3A和FCGR1C，这可能导致抗体依赖性的细胞细胞毒性。 研究者检测NSCLC微环境中巨噬细胞的浸润特征。NSCLC组织中巨噬细胞表达高水平的M2巨噬细胞标志物，包括CD163和CD206 (MRC1)(图6d)，这些标志物通过促进肿瘤发生而非抗肿瘤发生发挥作用。由于抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)主要归因于M1巨噬细胞，这些抗体可能与巨噬细胞相互作用，但很可能无法在NSCLC微环境中启动ADCC。 接下来，探讨这些抗体不依赖于ADCC的功能。肺癌中IgGs的许多新靶点是非细胞表面蛋白，但注意到这些IgGs的许多靶点是适配器蛋白，如AP2A1、AP2A2、AP2B1、AP2S1和AP2M1等AP-2复合物(图6b)。由于AP-2复合物被报道主要参与内吞作用，因此很有可能一些IgGs通过AP-2复合物被内吞到其他细胞。为验证这一假说，首先测定AP-2在肺癌微环境中的表达。AP-2蛋白在肿瘤细胞和肺癌单核细胞中高度表达。接下来，为评估AP-2在IgGs转运中的作用，研究者采用细胞模型进行IgG测定。在A549细胞中过表达AP2A1 (AP2复合体的核心成分，在肺癌肿瘤组织中高度表达)，并将纯化的人IgGs添加到细胞培养液中。在AP2A1过表达的细胞中，IgGs显著增加(图6e)，表明IgGs将以AP2依赖的方式进入肿瘤细胞。 接下来，为阐明转运到肿瘤细胞中的IgGs潜在功能，回顾上述蛋白质组学中发现的IgG结合蛋白和IgGs的细胞功能。研究者注意到，TRIM21（一种参与泛素依赖抗体靶标降解的fc结合蛋白）在病理IgGs的靶标中显著富集(图6b)。因此，推测病理IgGs可能通过其与肿瘤细胞中TRIM21的关联而促进特定靶点的降解。为解决这种可能性，研究者选择Rhoc作为LC-MS/MS中IgGs的代表性细胞靶点之一，并使用scRNA-seq分析这些靶点在肿瘤细胞中的表达(图6b)。Rhoc被报道NSCLC中过表达的癌基因，参与肿瘤细胞的增殖和转移。 研究者分别将病理的Rhoc IgGs和Rhoc缺失的IgGs电转到A549和H1299细胞中，发现Rhoc-IgG处理后，Rhoc的表达显著降低，而Rhoc-IgG缺失后，抑制作用减弱(图6f)。此外，将兔抗人Rhoc IgGs单克隆抗体电转到A549细胞中，观察到与病理Rhoc IgG相似的结果(图6g)，提示病理Rhoc IgG可能触发TRIM21通路，导致Rhoc蛋白降解。综上所述，这些结果表明IgGs在肿瘤细胞上的新作用，即IgGs可以通过AP2复合物进入肿瘤细胞。导入的IgGs通过Fab结构域识别其靶标，而Fc结构域与TRIM21相互作用并触发肿瘤细胞中泛素介导的RHOC降解(图6h)。 讨论 免疫抑制剂在治疗黑色素瘤和血液肿瘤方面取得显著成功，但其对实体癌类型的疗效仍相对较低。B细胞是适应性免疫系统中主要免疫细胞，在促进肿瘤及其微环境的协同进化中具有多种功能，但肿瘤浸润B细胞的功能仍未完全确定。在这里,研究者通过单细胞RNA-seq实验,发现NSCLC中浸润B细胞的新亚型,揭示NSCLC中渗透B细胞亚型的多种新功能,包括(I)渗透B细胞可分为两类，具有明显基因表达特征,(2)CD20+B细胞在NSCLC中抑制肿瘤生长,(3)IgGhigh B细胞在NSCLC早期阶段产生免疫球蛋白和抑制细胞生长,但在NSCLC晚期促进细胞生长,(IV)新靶点和功能蛋白质组学分析确定病理效应B细胞产生的抗体,(V)病理性抗体可通过AP2复合物导入肿瘤细胞并通过TRIM21介导的泛素途径降解其靶点。 CD20和CD19是最常见B细胞标记物，在NSCLC中发现了一个CD20-CD19-CD79A+CD79B+B细胞亚群。与CD19/CD20+B细胞相比，CD79A/CD79B在不同成熟和功能阶段的B细胞中广泛表达。研究者发现CD20+B细胞主要位于TLS,TLS密度与肺癌患者临床预后呈正相关。最近研究也表明，TLS的形成与癌症患者对免疫治疗的反应有关。我们的结果显示，CD20+B细胞可在疾病早期抑制肿瘤细胞的生长和进展，并与NSCLC的良好预后呈正相关。研究者发现CD20+B细胞中过表达的分泌蛋白，如VNN2、IFI30、PIK3AP1和SERPINA9。目前对肿瘤相关B细胞如调节性B细胞的研究主要集中在IL-10和TGF-β的分泌，这可能有助于T细胞的功能和T细胞介导的免疫应答的治疗效果。研究者还发现，CD20+B细胞在肺癌微环境中产生高水平的VNN2和SERPINA9，并直接抑制NSCLC细胞的生长。因此，探索CD20+B细胞分泌蛋白的功能可能是未来的方向。 在临床上，研究重点关注初始B细胞的预后影响以及初始B细胞特异表达的基因，如TLR10、FCRL1、BLK和TNFRSF13B在NSCLC中的作用。既往研究发现，浸润性B细胞与胃癌、前列腺癌预后不良有关，而NSCLC、乳腺癌预后良好。整合单细胞转录组数据和TCGA数据，进一步证实CD20+CD79A+B细胞在NSCLC中是有利的因子。新发现CD20+B细胞及其独特的表达基因可能用于预测NSCLC患者的预后。 通过一系列的实验证明B细胞在NSCLC中的多种功能，提示靶向B细胞亚型不是完全B细胞可能是未来B细胞免疫治疗的方向。此外，与血液样本B细胞相比，本研究的单细胞转录组学数据还发现NSCLC中B细胞亚型中特有表达的基因参考图谱。另一个未来方向是效应B细胞的显著功能和特异性表达基因(如CD38、MZB1)，以及它们在NSCLC细胞-细胞相互作用和癌-微环境协同进化中的可能作用。 研究者还提出NSCLC肿瘤细胞内吞抗体的新机制，分析显示，抗体与肺肿瘤中的AP-2复合物结合。AP2 (组装多肽2)复合物是最丰富的适配体之一，是网格蛋白介导的胞吞作用的主要参与者。前期研究揭示其在调控整合素胞吞中的作用。在本研究中，研究者发现在NSCLC中免疫球蛋白与AP2复合物直接相互作用，过表达AP2提高细胞免疫球蛋白水平，提示AP2直接参与NSCLC肿瘤细胞免疫球蛋白的胞吞作用。虽然免疫球蛋白在靶向细胞外蛋白中的功能已被深入研究，但细胞免疫球蛋白在肿瘤细胞中的作用很大程度上仍未知。本研究证明免疫球蛋白直接与TRIM21(包含21的三部分基序)相互作用。TRIM21是E3泛素蛋白连接酶和细胞质Fc受体，它与抗体的Fc链结合，并将泛素蛋白酶体传递给Fab识别靶标。最近的一项研究发现，抗体TRIM21-泛素-蛋白酶体可作为降解特定靶标的工具。报道病理性Rhoc抗体可以进入肿瘤细胞并导致NSCLC细胞系中Rhoc蛋白水平下降。由于Rhoc主要作为一种致癌基因发挥作用，输入Rhoc抗体可能负向调控肿瘤进展，提示这些IgGs具有潜在的抗肿瘤作用。 总之，本研究探索多种新B细胞亚型和免疫球蛋白调节NSCLC进展,新发现的B细胞多功能以及抗体表明在NSCLC微环境中靶向B细胞亚型具有临床意义。此外，本研究的单细胞转录组和蛋白质组学分析免疫球蛋白抗原为未来NSCLC中B细胞和其他免疫/基质细胞的研究提供重要资源，最终可能应用于临床实践。 更多推荐 1 科研 | Cell：单细胞RNA测序揭示治疗诱导的人类肺癌进化 END |
|
|
