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编译：微科盟 伊一，编辑：微科盟景行、江舜尧。 微科盟原创微文，欢迎转发转载。 自闭症谱系障碍(ASD)在男性中的诊断频率是女性的3到5倍，这是一种显著的性别偏见患病率，表明性别差异参与了生物因素调节。人脑组织转录组分析的基因组规模可以为在性别差异和ASD影响的神经生物学的交叉点上识别基因和相关功能过程提供一种公正的方法。近年来，随着样本量和细胞分辨率的增加，已经发表了几项表征ASD脑中基因表达变化的研究。这些研究报告了ASD大脑中数据集和遗传异质性样本之间的几种趋同模式，包括与胶质细胞和免疫功能相关的基因集表达升高，与神经元和突触功能相关的基因集表达降低。对神经典型皮层组织的评估报告了性别的平行模式，男性高表达重叠的胶质细胞/免疫相关基因组，女性高表达神经相关基因，表明这些细胞类型在性别差异的ASD风险机制中的潜在作用。然而，验证和进一步探索这些机制受到了现有数据的挑战，因为现有的ASD脑研究包括有限数量的女性ASD供体，并且主要集中在尚不知道显示明显性别差异形态或功能的皮质区域。这篇综述总结了几项关于自闭症谱系障碍大脑转录组及其与性别差异基因表达关系的里程碑式研究的趋同性发现，并讨论了自闭症谱系障碍性别差异转录组分析的局限性和未来问题。 论文ID 原名：Neural Transcriptomic Analysis of Sex Differences in Autism Spectrum Disorder: Current Insights and Future Directions 译名：自闭症谱系障碍性别差异的神经转录组分析:当前观点和未来方向 期刊：Biological Psychiatry IF：12.095 发表时间：2020年12月 通讯作者：Donna M. Werling 通讯作者单位：威斯康辛大学麦迪逊分校 DOI号：10.1016/j.biopsych.2020.11.023 研究进展 自闭症谱系障碍(ASD)是一种普遍的神经发育障碍，目前在美国约有1/54的儿童受到影响。相对于女性而言，男性的确诊率是女性的3到5倍，自闭症是性别最偏向的神经精神疾病之一。尽管患病率存在这种差异，但比较受影响男性和女性ASD临床表型的大规模研究描述了女性受限和重复行为的减少和对社会沟通特征的可变性别影响，但性别之间的总体严重程度相似。常见的遗传变异体和罕见的从头高度有害的变异体都会增加房缺风险。虽然涉及几个X染色体位点，包括FMR1(脆性X综合征)、MECP2(雷特综合征)、NLGN3和NLGN4X ，但大多数已知的风险变异是常染色体。几个常染色体ASD风险基因优先与一种性别的发育障碍相关，包括CHD8、MBD5和SYNGAP1 中罕见有害变异的ASD病例中男性偏高的发病率，但这些差异背后的机制尚未完全了解。 图1.性别差异转录组分析的研究设计和结果。(A)障碍状态下性别差异的表征需要对男性和女性病例进行比较。(B)性别差异风险中涉及的基因和过程的识别需要比较神经典型的男性和女性对照以及对照和病例队列的比较。(C)推测的病理生物学基因被预测在紊乱状态和更频繁受影响的性别中表现出高表达。(D)推测的保护性基因在紊乱状态下表现为表达减少，而在较少受影响的性别中表现为表达增加。 通过在基因组规模上产生组织和细胞中分子功能的近似读数，大脑中的转录组分析对于探索大脑疾病的神经生物学是有用的，并且可以提供补充基因发现工作的信息。通过应用适当的统计方法，转录组分析的基因组规模允许不偏不倚地发现条件中涉及的生物过程，并促进跨基因组规模数据集的生物信息学比较，以确定趋同点。转录组研究也可用于描述特定条件或特征中的性别差异，包括受影响的男性和女性之间的差异以及性别差异风险机制。识别疾病状态中的男女差异，这可能提示性别差异病因或对疾病的反应，需要足够有力和平衡的受影响男性和女性样本(图1A)。性别差异风险的调查需要将病例对照比较与基线神经典型性别差异的特征相结合，以确定受性别和障碍生物学影响的基因和相关生物学过程(图1B)。这些基因可以根据它们对风险的影响方向进一步分类。在疾病状态和更频繁受影响的性别(男性，ASD)中具有高(er)表达的基因更有可能参与或标记疾病病理生物学的性别差异脆弱性机制(图1C)。 考虑到这一目标，这篇综述旨在描述ASD脑组织转录组模式的标志性研究的关键结果，并描述ASD相关的变化如何与神经典型的性别差异交叉。此外，还讨论了这些模式对性别差异风险机制的影响，目前可用数据集的局限性，以及未来研究的问题。  迄今为止，已经发表了几项标志性的研究，描述了自闭症谱系障碍与对照脑组织和细胞的转录组差异。然而，可从ASD供体获得的脑组织很少，因此这些研究依赖于有限的样本量(表1)，从早期基因表达研究中的6名ASD供体到最近关于大量脑组织转录组学的报告中的48名ASD供体。关键是，研究样本并不是完全独立的。总的来说，在这5项研究中分析的组织来自160个独特的供体:69名自闭症患者和91名对照受试者。这些数字相对较小，不足以解决已知的自闭症谱系障碍的遗传和表型异质性，而且它们也落后于其他神经精神疾病(如精神分裂症)的转录组数据生成，最近一份来自CommonMind联盟的出版物包括353例。相对于遗传分析，组织可用性限制了两种情况的脑转录组研究，其中最近的全基因组关联研究包括18，381例ASD 和36，989例精神分裂症，罕见变异分析包括11，986例ASD 和3444例精神分裂症。 与自闭症的男性倾斜患病率一致，所有的数据集都是男性主导的:在总共69名自闭症捐赠者中，只有14名是女性。正好所有病例组和对照组都是性别匹配的，减少了性别与病例对照状态混淆的可能性，但直接限制了可用于分析的女性大脑转录组的数量。病例组和对照组女性数据的缺乏为描述以下差异表达模式提出了重大挑战:1)男性和女性ASD病例之间的差异表达模式，如已观察到的重度抑郁障碍(23，24)和创伤后应激障碍(25)，2)女性病例和对照组之间的差异表达模式，以确定女性ASD大脑如何偏离性别特异性预期，以及3)通过诊断确定性别相互作用效应，其中ASD转录组的变化在性别之间的影响幅度或方向不同。 尽管样本量相对较小，但对大量脑组织的研究已经成功描述了ASD神经转录组的变化。一种更为一致的观察模式是星形胶质细胞、小胶质细胞、免疫和炎症功能相关基因的高表达，这是Garbett等人首次报道的。对来自自闭症组织项目(现为www.autismbrainnet.org自闭症脑网)的6对自闭症对照的微阵列数据进行差异表达分析，发现自闭症颞上回中抗原特异性和细胞特异性免疫反应、炎症、自身免疫和免疫介导的细胞死亡GO类别的基因表达增加。随后使用微阵列或RNA测序对大块组织进行的更大规模的研究，通过功能注释基因共表达网络或模块，概括了这种模式。Voineagu等人发现了一个标记为M16的模块，该模块富含与星形胶质细胞和小胶质细胞功能相关的基因，并在ASD脑中相对于对照组上调。Gupta等人2014年的一项研究使用了一个更大的样本和有标注的共表达网络，将M16分解为单独的星形胶质细胞相关(Mod7)和活化的小胶质细胞相关(Mod5)模块，尽管经过多次测试校正后，只有ASD升高的Mod5表达是显著的。由Parikshak等人进行的最新和最大的研究通过鉴定在ASD中表达显著升高的3个模块进一步扩展了该信号的分辨率，包括一个星形胶质细胞标记物明显富集的模块(CTX.M9)和另一种富含小胶质细胞标记物(CTX.M19) 尚不清楚胶质细胞参与的这些假定变化是上游风险暴露的次要后果，还是星形胶质细胞和小胶质细胞参与了ASD的主要症状相关病理。这里描述的研究都没有观察到ASD遗传风险因素的富集，包括在任何ASD升高的胶质细胞/免疫相关模块中的罕见或常见的变异，这表明驱动这些升高的表达模式的功能变化可能是遗传风险变异的直接影响的下游。无论这些变化是因果因素的下游还是上游，它们都有可能是ASD症状的上游(并导致ASD症状)，这将对胶质细胞/免疫通路作为治疗靶点的效用产生影响，未来的实验工作需要解决这种可能性。 大量组织转录组分析还发现了与神经元和突触功能相关的模块，这些模块通常在ASD皮层中表达减少。Voineagu等人报道了一种与突触功能、囊泡转运和神经元投射相关的ASD下调神经元模块(M12)，Gupta等人将M12分解为3个模块，所有模块都富集突触传递功能。在这3个模块中，Mod6在ASD中显著上调，而Mod1基因被发现与突触传递相关的抑制性离子通道活性相关，且显著下调。Parikshak等人后来确定了3个ASD下调模块(CTX.CTX、M4.M10、CTX.M16)也与M12模块重叠，并富含神经元标记和突触基因，这些作者还暗示神经元放电率是CTX.M10和CTX. M16模块的一个关键特征。 与上调的胶质细胞/免疫基因相反，下调的神经元/突触基因显示出与ASD遗传风险重叠的一些证据，这可能表明这些基因表达的变化可能更接近ASD的因果根源。使用置换试验评估早期ASD全基因组关联研究中常见变异关联信号的基因集富集，Voineagu等人观察到M12基因的ASD常见变异风险显著富集。然而，Gupta等人和Parikshak等人的发现并不支持最初的遗传风险富集，而是仅在未显示显著表达变化的模块中发现ASD的罕见变异风险基因富集，并在ASD上调的CTX.M20模块中发现常见变异ASD全基因组关联研究信号弱富集，这些对比发现表明，影响神经元的上游遗传风险和下游转录变化可能涉及可分离的基因集和功能。  在ASD脑大量组织分析中报告的其他表达变化包括脑区之间的差异、不同遗传病因病例之间的相似性以及个体供体之间的差异。皮质和小脑组织的评估研究观察到皮质中更大幅度的表达变化，导致皮层与小脑相比，显著的自闭症基因表达差异[444 vs 2个基因和1142 vs 0个基因]，表明出生后皮质对ASD转录变化的敏感性更高。比较额叶和颞叶皮层组织的差异表达分析发现ASD中区域差异表达基因的数量减少[对照样品中的510 和551 个基因，而ASD样品中的8 和51 个基因]，这表明ASD中皮层模式不太明显，可能被破坏。对9例15q11.2-13.1重复综合征(dup15q)患者的数据和特发性ASD病例的样本进行分析后发现，这两组病例的转录组变化有惊人的相似性，表明异质性遗传风险暴露下游的趋同神经生物学变化。然而，个体样本中的表达变化比群体平均水平显示的变化更大。虽然来自ASD供体的组织比对照样品更有可能显示神经元/突触基因表达相对降低和胶质细胞/免疫基因表达升高，但这并不普遍存在于所有ASD样品中(图2)。至关重要的是，这些方向性的表达变化似乎并不是男性特有的，因为女性样本与男性样本显示出相同模式的可能性相似。 虽然来自大量组织测序的差异表达基因可以注释为特定细胞类型的功能，但大量组织分析不能明确区分这些表达变化的细胞来源，也不能明确区分细胞数量和细胞类型的影响——内在表达变化。单细胞RNA测序可以开始解决这些未知问题。Velmeshev等人发表了第一个ASD数据集，从4-22岁的ASD病例和对照受试者的前额叶和前扣带皮层产生了单核RNA测序数据。在鉴定的17种细胞类型簇中，原生质星形胶质细胞是唯一一种在ASD中比对照组更普遍的细胞类型，这表明细胞类型组成的改变可能导致ASD脑组织中胶质细胞/免疫基因表达的升高。在每组中进行的细胞类型特异性差异表达分析进一步表明，ASD中最显著升高的基因主要在原生质星形胶质细胞或小胶质细胞中观察到，而ASD中最显著降低的基因主要在皮层2/3兴奋性神经元和血管活性肠多肽阳性中间神经元中观察到。这项研究还报告了差异表达基因中罕见变异相关ASD风险基因的富集，这种富集在第4层和第2/3层兴奋性神经元和血管活性肠多肽以及生长抑素阳性中间神经元中显著高于预期。类似地，一项独立分析报告了杏仁核中间神经元ASD风险基因的下调，但没有观察到杏仁核小胶质细胞和星形胶质细胞ASD相关基因的上调，这表明这种模式可能是区域特异性的。这些早期发现是有希望的，来自大量个体供体和更广泛大脑区域的未来数据生成将为在细胞水平上表征ASD的分子变化以及它们如何与遗传易感性和整体ASD病理相关提供有价值的见解。 与对照样本相比，自闭症谱系障碍脑组织中的转录组改变定义了与障碍状态相关的变化，为了阐明自闭症谱系障碍的性别差异风险机制，有必要了解这些障碍相关模式如何与神经典型性别差异交叉或相互作用(图1B)。2016年的一项研究通过比较一系列神经典型皮层组织的性别差异表达分析结果与ASD相关基因表达变化和风险基因，直接解决了这个问题。具体来说，Werling等人应用了一个线性混合效应模型来表征3个数据集的性别差异表达:一个成人数据集，包括来自BrainSpan，5名男性和5名女性提供的58个皮层样本，年领跨度13-40岁；一组产前数据集，包含4名男性和4名女性的86个皮质样本的数据集，年龄为孕后16-22周；以及一个成人复制数据集，包括13个皮质样本，分别来自5名男性和5名女性，年龄在16-56岁之间。 在成人发现和产前数据集中，属于ASD升高的胶质细胞/免疫模块中任一个的基因(M16和Mod5) 明显更有可能表现出偏向男性而不是偏向女性的表达，并且M16基因在成人复制数据中也明显偏向男性。成人和产前皮质中的男性偏向基因也显示出多种来源定义的星形胶质细胞和小胶质细胞标记基因的显著富集。相反，属于Asddown调节的神经元/突触模块(M12，Mod1)的基因在成人发现数据中更有可能表现出偏好女性的表达，尽管这种模式在产前或成人复制组中没有观察到。ASD风险基因，包括来自SFARI(西蒙斯基金会自闭症研究计划)基因数据库的候选基因(https://gene./)和在ASD病例中具有罕见从头蛋白质截短或错义变异的基因，在任何数据集中都没有因性别差异表达而富集，这与驱动ASD性别偏见患病率的机制很大程度上在遗传风险变异的下游运行的工作模型一致。  随后纳入了40名供体(23名男性，17名女性)的594个样本，对大脑数据集时空范围的神经典型性别差异表达的分析，年龄从孕后8周到40岁。Parikshak等人报告的6个ASDDysM调节模块在不同发育时期皮质组织中的性别差异表达模式，证实了先前的观察:所有神经元相关模块在整个发育过程中显示出很大程度上的性别中性表达，而星形胶质细胞和小胶质细胞相关模块在胎儿发育的中晚期显示出男性偏向的表达，CTX.M9在成年期还显示出男性偏向的表达(图3)。值得注意的是CTX.M9中的男性偏向星形胶质细胞相关基因包括APOE和像RERG和SLCO1C1这样的基因，它们与对激素的神经反应有关。与CTX.M19对小胶质细胞功能的富集相一致，CTX.M19中的超级男性偏向基因包括LYN、B2M和RHBDF2，它们与免疫细胞信号和过程的调节和反应有关。为了进一步解决产前性别差异，一项研究对120名妊娠中期人类供体的整个大脑的转录组模式进行了表征，并发现了2756个性别差异表达的基因。与上述BrainSpan的发现相反，这些差异表达的基因显示出高置信度ASD风险基因的显著富集，尽管性别效应的方向是分裂的，有7个男性偏向和5个女性偏向的风险基因。 在皮质组织中看到的这些ASD和性别差异表达模式表明，在神经典型男性(与女性相比)和ASD(与对照组相比)的神经生物学特征中存在平行转移。一直观察到星形胶质细胞/小胶质细胞/免疫基因的男性偏好表达，与ASD上调表达分离并相关，而ASD下调的神经元/突触基因在不同的数据集上呈现不同的女性偏斜。在任一功能类别中，来自更频繁受影响的性别(男性)的神经典型组织在转录上比女性更接近ASD，这表明神经胶质的/免疫的/神经元生物学可能参与性别差异风险机制。基于ASD与对照组的作用方向，研究者假设胶质细胞功能和/或细胞数量的增加与ASD病理生物学相关，而神经元功能或细胞数量的维持或相对升高可能是保护性的(图1C，D)。需要进一步的研究，包括更广泛的单细胞转录组学，以确定细胞类型组成和分子功能如何导致大块组织中的性别差异，并且需要神经生物学实验来研究涉及这些细胞类型的假定病理生物学和保护机制。重要的是，皮质组织中与ASD遗传风险相关的基因的性别平衡表达表明，至少在皮质中，性别差异风险调节机制在遗传风险因素的下游运行，而不是作为风险基因表达的上游调节者。对于像ASD这样的遗传异质性疾病，这是一个有希望的观察结果，因为它表明针对下游病理的干预措施可能能够调节不同遗传病因患者的症状。 结论、局限及展望 尽管本文综述的研究提供了对ASD神经生物学和性别差异风险机制的见解，但这些发现受到多个维度样本可用性的限制，包括性别、年龄、脑区和细胞类型。目前，在主要转录组研究中，只有14名女性ASD供体的可用数据，在表征受影响男性和女性之间的性别差异、分析女性特异性从性别匹配的转变以及确定性别和ASD之间的相互作用影响的能力方面受到显著阻碍。 这种工作因年龄而变得更加复杂。自闭症是一种神经发育性但终身的疾病，自闭症患者大脑中的基因表达变化在整个发育过程中不是静态的。性别差异生物学同样是动态的，在包括早期性别分化、青春期和更年期在内的特定阶段展开和转移。彻底理解性别差异风险和自闭症谱系障碍的神经病理学需要理解这两个发育移动目标之间的相互作用。关于早期发育，可能来自神经典型人类组织的转录组数据在胎儿中期相对最可用，此时ASD风险基因也强烈表达和共表达。然而，胎儿晚期和儿童早期的人类组织样本很少，获得产前推测的ASD组织需要对已经罕见的情况进行胎儿基因诊断。这里描述的ASD研究样本(表1)和以发育为重点的数据集，如BrainSpan和BrainVar ，包括跨越青春期的样本，但它们都缺乏关于供体青春期状态的表型信息，并且缺乏足够数量的男性和女性在这个阶段进行有力的比较。大规模数据集很好地涵盖了成年期，如基因型-组织表达(GTEx)项目，尽管后者倾向于老年人，因此大多数纳入的女性可能处于围绝经期或绝经后。进一步挑战彻底表征脑转录组中基线性别差异的能力，女性供体在这些数据集上几乎普遍代表性不足:对于神经系统组织，男性/女性比例在GTEx中约为2.5:1，在BrainSpan中约为1.3:1，在BrainVar总体中约为1.4:1，在出生后样本中约为2.4:1。 现有的ASD大脑转录组数据也是区域性的，主要集中在皮层和小脑。ASD风险基因在皮质组织和皮质神经元中强烈表达，转录组变化在ASD和神经典型男性皮质中明显，但ASD相关的变化尚未在许多皮质下脑区中得到表征。因此，尚不清楚ASD病因和性别差异生物学是否直接在皮质中相互作用，或者其他大脑区域是否在性别差异风险机制中发挥更大作用。神经内分泌学和神经行为学研究在皮质下脑区(如下丘脑和终纹床核)中有详细的细胞和形态性别差异。这些皮质下区域也可能直接和强烈地参与ASD相关的病理，或者ASD风险可以通过将性别差异区域与ASD影响区域物理连接的神经回路来调节。然而，这些区域的大量组织转录组由于其解剖复杂性(例如，多个小的和功能不同的下丘脑核)在过去已经被大大地去优先化了。单细胞和空间转录组技术现在促进了这些具有挑战性的区域的表征，并可用于表征或排除它们与房缺性别差异风险的关系。无论是在皮层下区域还是皮层，单细胞分析对于更好地描述直接参与ASD病理和性别差异生物学的细胞类型和/或细胞状态，以及这些细胞类型对表型的可能机制至关重要。皮层中的单细胞转录组数据已经表明了细胞类型组成和细胞类型特异性改变在ASD相关基因表达模式中的可能作用，但需要额外的数据生成来验证和完善这些发现。 展望未来，体内和体外模型系统也将是探索ASD相关遗传变异在性别、精确选择的发育阶段和多个脑区的转录、功能和行为后果的关键工具。与人类皮质类似，对几种ASD风险基因座小鼠模型的转录组特征，包括Chd8、Arid1b、Shank3b和16p11.2缺失，发现了与轴突导向和谷氨酸能神经传递的神经元功能相关的基因模块的下调。Chd8(一种顶级ASD风险基因)的杂合突变系也一致显示其他已知ASD风险基因的表达减少，一项研究观察到Chd81/2突变体中上调的基因中免疫反应相关的ASD上调基因的富集，而另一项研究观察到Chd81/2下调基因中ASD下调的神经元相关基因的富集。这些模式部分验证了人类大脑中报告的变化，并证明了非人模型将特定遗传风险变异与更广泛的下游转录后果联系起来的潜力。然而，到目前为止，这些研究集中在独立于性别影响的无序相关变化，这必须在未来的分析中直接解决。动物实验也还没有证明胶质细胞基因表达的升高是自闭症的原因还是结果。进一步的实验工作破坏了对改变的共表达网络至关重要的“中枢基因”，或者以与这些模块相关的特定细胞类型的功能为目标，这可能有助于确定胶质细胞功能的增加(或神经元功能的减少)是否有助于大脑功能和行为的表型变化，或者与大脑功能和行为的表型变化简单相关。 从ASD患者样本中获得的人类诱导多能干细胞是另一种有用的模型，具有作为人类细胞的明显优势，比脑组织更容易获得，并且能够在非常早期的发育阶段进行建模。hiPSCs分化为兴奋性和抑制性神经元的转录组分析结果遵循死后脑组织的结果，包括参与神经元分化的基因网络的失调、神经元投射和模式的发展以及突触信号传导。然而，可以从hiPSCs中获得的神经细胞类型目前是有限的，并且还不知道在细胞培养系统中可以概括性别差异生物学的哪些方面，使用或不使用性类固醇激素。探索星形胶质细胞或微神经胶质细胞共培养所需的实验条件，以及适当模拟性别差异，可以提高hiPSCs在该领域实验工作中的效用。 从整体来看，从人类研究到模型系统，女性ASD样本的有限可用性和对性别作为生物变量的有限关注阻碍了作者描述和理解ASD病理和风险中性别差异的能力。对自闭症障碍状态和一般人群中性别差异的进一步描述对于自闭症障碍和其他具有性别差异患病率或表现的神经精神和神经障碍将是重要的，并且将更好地为描绘机制的实验工作奠定基础。为了实现这一目标，作者鼓励各个实验室、资助机构和期刊促进或加强将女性样本纳入所有人类和模型工作，并尽可能推动性别平衡样本集的分析，即使是在性别失衡的情况下。特别是在转录组学研究中，更广泛地说，在临床前和临床研究领域，关注这个问题非常重要，因为了解疾病状态和风险中的性别差异对于揭示疾病病理学的基本方面以及设计对男性和女性患者都有利的治疗方法具有很大的潜力。 |
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