1 测序方法分类测序方法分类
2 基因组测序2.1 全基因组测序
2.2 全外显子组测序摘自“纳昂达科技”公众号《全外显子捕获那些事》—https://mp.weixin.qq.com/s/wZqmMc0WXaAy0AYkLCeDAg 外显子测序流程及注意事项
2.3 靶向基因组测序采用靶向测序,一组基因或基因组区域可被分离出来并对其进行测序。靶向测序让研究人员能够将时间、费用和数据分析集中在感兴趣的特定区域,并在更高的覆盖度水平上开展测序。在目标富集中,感兴趣的特定区域通过与生物素标记的探针杂交而被捕获,之后通过磁性分离。扩增子测序采用高度多重PCR 寡核苷酸组对感兴趣的区域进行扩增和纯化。
2.4 文库构建试剂盒试剂盒及厂家
3 转录组测序RNA seq
3.1 RNA分类人RNA大小及分布
Boivin V, Faucher‐Giguère L, Scott M, et al. The cellular landscape of mid‐size noncoding RNA[J]. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 2019, 10(4): e1530. 人类基因组编码及非编码RNA分布
Malek E, Jagannathan S, Driscoll J J. Correlation of long non-coding RNA expression with metastasis, drug resistance and clinical outcome in cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(18): 8027. 3.2 全转录组测序(Total RNA)全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下转录出的所有转录本的总和,包括mRNA和所有的non-coding RNA。全转录组测序应用RNA-Seq技术,通过构建两种文库(small RNA文库和去rRNA的链特异性文库),对四种RNA(miRNA,lncRNA,mRNA,circRNA)的表达及调控关系进行分析。 技术路线及参数设置
3.3 转录组测序(mRNA)转录组(Transcriptome)是指细胞内所有转录产物的集合,包括mRNA、non-coding RNA等。转录组具有时空特异性,通过转录组能够从转录水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定生物学以及疾病发生过程中的分子机理。转录组测序(RNA-seq)是利用高通量测序获取转录组中mRNA的信息,通过分析基因表达量以及结构的变化,挖掘致病机制,阐明发病机理,指导用药以及药物研发。 mRNA seq
3.3.1 干扰rRNA去除由于直接对样本的total RNA进行测序将会产生大量无用rRNA冗余信息,因此在提取到total RNA之后,需要对其中的背景RNA进行去除(如占total RNA约80%-90%的rRNA),去除背景干扰的方法有两种:
2)“-”法,rRNA直接去除法 rRNA去除方法
Sorek R, Cossart P. Prokaryotic transcriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity[J]. Nature Reviews Genetics, 2010, 11(1): 9-16.
3.3.2 片段化处理mRNA纯化之后的文库构建通常有两种思路,一种是先用oligo(dT)引物反转录mRNA,再进行cDNA的片段化,另外一种则是先将mRNA打断,再结合随机引物进行反转录。
3.3.3 反转成双链cDNA在做mRNA测序文库构建的时候,一般分为常规建库和mRNA链特异性建库。链特异性文库和常规mRNA文库最大的区别在于合成第二链cDNA时加入的核苷酸种类,如果要构建常规mRNA文库,则加入dNTP,而如果要构建链特异性mRNA文库则加入dNTP中使用dUTP代替dTTP,这样合成的第二链cDNA含有U碱基,后期再通过识别U碱基的方法去除第二链cDNA,从而达到构建链特异性mRNA的效果,具体方法包括:使用特殊酶不扩增带有U碱基的链;使用UDG酶去除带有U碱基的合成链。 3.4 小RNA测序Small RNA是一大类调控分子,几乎存在于所有的生物体中。Small RNA包括:miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通过多种多样的作用途径,包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除,来调控生物体的生长发育和疾病发生。 image.png
3.5 环状RNA测序环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子,与传统的线性RNA(linear RNA)不同,circRNA分子合呈封闭环状结构,且不受RNA外切酶影响,表达更稳定,不易降解。 image.png
4 表观遗传学测序4.1 甲基化测序人类大约有30亿个碱基对,DNA主要发生在CpG二核苷酸上,基因组中大约有2800万个CpG位点。这些CpG位点中,大约6080%被甲基化,而在一些特定的区域,比如启动子,存在CpG位点富集的序列,我们称之为CpG岛,CpG岛通常未被甲基化。但是在肿瘤细胞中,整体甲基化水平降低至2050%,与正常细胞相比,即可能有1060%的CpG位点的甲基化状态发生了改变,也就是大约2801680万个CpG位点。 image.png
DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、鸟嘌呤的N-7位、胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。 DNA甲基化测序方法有上百种,大多数方法依赖DNA的亚硫酸氢盐转化来检测未甲基化的胞嘧啶。在文库制备过程中,亚硫酸氢盐的转化会将未甲基化/未羟甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。在弱酸性条件下,亚硫酸氢根会结合到没有甲基化的C碱基的6位。而甲基化了的C碱基不会和亚硫酸氢根发生这个反应。然后用碱来处理。结合了亚硫酸氢根的非甲基化的C,就被脱氨基、脱亚硫酸根。被转化成U碱基。用亚硫酸氢盐来处理DNA,可以让99%左右的非甲基化的C碱基变成U。经过亚硫酸氢盐转化过的DNA,再经过PCR合成出来的链,U碱基的位置,就会被替换成了“T”。而甲基化的C,因为没有被亚硫酸氢盐所转化,所以,在接下来的测序过程中,被测到的,还是“C”碱基。通过测序看一个位置是“C”还是“T”。如果是“C”,就说明这个位置是被甲基化/羟甲基化。如果是“T”,则说明这个位置是没有被甲基化/羟甲基化。 重亚硫酸氢盐处理碱基变化1
重亚硫酸氢盐处理碱基变化2
4.2 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)通过染色质免疫沉淀(ChIP)检测和测序技术相结合,ChIP测序(ChIP-Seq)成为鉴定转录因子及其他蛋白因子在全基因组范围内的DNA结合位点的强有力方法。在ChIP操作之后,通过特异抗体将DNA结合蛋白免疫沉淀。结合的DNA被同时沉淀、纯化并测序。 image.png
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