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CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。 Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。 使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合（如Cas9n，dCas9），从而带来更多变的实验方案。 AAV SagRNA表达载体是专门搭配SaCas9使用的。SaCas9来源于Staphylococcus aureus，其序列比来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9要短1 kb以上。因此较小长度的SaCas9序列更适合小装载量的AAV病毒的包装生产。SaCas9与SpCas9有两个方面的差异：第一，SaCas9要求搭配的gRNA的骨架序列与SpCas9要求的不同。与SaCas9适配的gRNA叫SagRNA；第二，SaCas9识别的PAM序列是NNGRR（优先NNGRRT），而SpCas9识别的PAM序列为NGG（较多情况）和NAG（少数情况）。 AAV SagRNA表达载体既可以表达单SagRNA也可以表达双SagRNA。单SagRNA被常用于传统的基因编辑如基因敲除，而双SagRNA适用于需要用2个gRNA同时打靶基因组两个区域的情况，如造成两个DSB之间的片段删除，同时打靶两个不同的基因等当一个SagRNA载体上含有单个人U6启动子时可以驱动两个ITR区域之间的单SagRNA表达。双SagRNA载体则含有两个U6启动子用以驱动两个特异于打靶序列的SagRNA表达。 AAV SagRNA表达载体首先在构建可在E. coli中复制的质粒DNA，然后与辅助质粒一并转染至包装细胞。位于载体上的两个ITR区域之间的序列将被包装至有活性的病毒颗粒当中。病毒转导时，两个ITR区域之间的SagRNA表达盒连同病毒基因组的其他组分都会进入靶细胞。表达盒中的人源U6启动子将驱动SagRNA序列转录。SagRNA随后引导SaCas9打靶目的序列。 野生型AAV基因组（ssAAV）是一条线性单链DNA分子（ssDNA），并含有两个ITR区域在基因组的两端形成发夹结构。ssAAV在细胞内进行表达时，其基因组首先需要被转化成双链DNA（dsDNA），这个过程有两个途径：1. 使用宿主细胞的DNA聚合酶和ssAAV基因组上的3’ ITR序列作为引物结合点合成第二链DNA；2. ssAAV基因组的正义链和负义链之间形成分子内的dsDNA结构。两种途径中前者是形成dsDNA的主要方式。 AAV线性双链DNA基因组在细胞核内会形成游离形式的多联体。在非分裂细胞中，这些多连体会长久存在直到宿主细胞死亡。而在分裂细胞中，游离的DNA多联体会因为细胞分裂而被稀释，这是因为游离DNA不能随着宿主基因组复制而复制。AAV基因组随机整合宿主基因组的概率是很小的。AAV的这种特性对于应用于基因治疗是可贵的，因为载体上的外源DNA整合宿主基因组的情况是有潜在的致癌性质的。 AAV的一个主要优点是，在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中操作。AAV是复制缺陷型的、不会引起炎症反应和引发人类疾病。 人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性（即感染组织特异性）。 |
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