超详细干货|制药企业分析方法验证、确认和转移要求及流程（上）

ICH的指南性文件Q2（R1）论述了在一个分析方法验证中需要进行的验证项目，一方面主要是对分析方法验证的定义和相关术语进行了解释，另一方面主要是对分析方法验证的方法学进行了详细阐述。

01

分析方法相关术语

名词	定义
方法验证	根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容和验证标准要求，并通过设计合理的实验来验证所采用的分析方法是否符合检验项目的要求。
方法确认	证明法定方法、注册方法或已验证的分析方法在本实验室的适用性的一系列活动；确定样品在特定条件下可以由已验证过的方法在特定条件下进行测试。
方法转移	指非法定分析方法在同一公司不同实验室之间或不同公司实验室之间的转移，即记录一个实验室（接收方）能够使用其它实验室（转移方）研发并经过验证的分析方法的过程，通过实验证明接收实验室能够使用其它实验室验证过的分析方法并重复的产生正确的测试结果。
鉴别试验	旨在确认样品中的一种被测物的特性。通常将样品的性质（如光谱、色谱行为、化学反应性等）与参比对照品的性质进行比对。
杂质检查	指样品中杂质（包括残留溶剂）的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的纯度。定量试验所需论证项目与限度试验相比是不同的。
含量测定	指样品中主成分的含量。
系统适用性	系统适用性试验是分析方法的必要组成部分。它们可以被用来证实色谱系统的分离度和重现性是否适用于分析的要求。设备、电子元件、分析操作和被分析样品组成的一个完整系统，系统适用性参数是根据被论证的方法类型，对某一特定方法而建立的。
专属性	指在其他成分（如杂质、降解物等）可能存在下，采用的分析方法能够准确测定被分析物质的特性的能力。
线性	指在设计的范围内，检测结果与试样中被分析物的浓度（量）直接成正比关系的程度，常用相关系数r表示。
相关系数（r）	变量x和y的关联程度。用下列公式进行计算：
范围	指能够达到准确度、精密度和线性要求的测试方法中被分析物的高低限浓度或量的区间。
准确度	指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值之间接近的程度，有时也称真实度，一般以回收率（%）表示。准确度可以通过标准物添加法来确定。（例如：用加样回收率来表示）
检测限	指试样中被测物能被检测出的最低量，通常用ppm或相对于样品的百分浓度来表示，反映了该方法在该仪器上的灵敏度，但不一定要准确定量。
定量限	指试样中的被分析物能够被定量测定的最低量，通常用ppm或相对于样品的百分浓度来表示，其测定结果应具有一定的准确度和精密度，它是样品中含量低的化合物定量测定的参数，特别适用于杂质或降解产物的定量测定。
耐用性	指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使该方法可用于常规检验提供依据。
系统精密度	系统精密度考察操作系统的误差，与制备过程无关。
精密度	指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度包括重复性、中间精密度和重现性。
重复性	是指在相同的操作条件下，较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。
中间精密度	是指在同一实验室内，不同时间由不同分析员用不同设备测定结果之间的精密度。即在实验室内部条件改变，如：不同日期、不同人员、不同仪器等情况下的精密度，来考察随机变动因素对精密度的影响。
重现性	是指不同实验室之间由不同分析人员测定所得结果的接近程度(不同实验室的合作研究，通常用于方法学的标准化，如果在方法验证过程中有重现性结果，则中间精密度可不做）。

02

分析方法验证、确认和转移方案和报告的具体内容及要求：

2.1分析方法验证、确认和转移的要求

操作人员必须是经过相关培训合格的分析员，所用分析仪器已经通过确认或校验，并在有效期内；用的化学试剂必须符合试验要求的级别，并在有效期内。实验必须依据预先确定和批准的方案进行，并有详细记录。试验过程中应详细记录由明显的实验室错误导致的任何异常或失败测试，若有不符按照偏差流程进行调查。

2.2分析方法验证、确认和转移方案的起草、审核和批准

分析方法验证、确认和转移试验方案包括但不限于以下内容：详细描述被验证、确认或转移的分析方法信息，明确需要进行验证的项目及预期标准，详细描述各验证项目的验证步骤，关键配制过程包括样品称量、定容、稀释等试验过程的描述，进样要求、结果分析、数据要求，以及其他可能会影响到验证过程的信息。

2.3分析方法验证、确认和转移报告的起草、审核和批准

分析方法验证报告应提供完整的数据并对验证方案要求的所有验证项目进行评估，出现的所有的偏差都必须记录且在报告中加以讨论。任何评估人员认为所产生的偏差过大，整个验证程序就必须重做（如验证方案、验证活动、验证报告）。分析方法验证报告一旦通过，所用测试方法的实验条件便可以使用。

2.4分析方法验证、确认和转移方案及报告的保存

最终的方法验证总文件包（包括方案、报告和试验记录等）均应由QA保管。

2.5需验证的检测项目

根据检测项目的设定目的和验证内容的不同，可将需要验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验或定量试验）、定量测定（含量测定）、微生物学检查（微生物限度检查、细菌内毒素检查等）、其他特定项目检测。

03

验证的内容（重点干货）

分析方法验证包括：专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限、耐用性、溶液稳定性、系统适用性等。

3.1专属性

一般情况下，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。

3.1.1鉴别反应的专属性验证

鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构类似化合物区分，需确证含被分析物的样品呈正反应（可与已知对照物比较），而不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，应均呈负反应。

3.1.2杂质检查的专属性验证

作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、残留溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质之间能得到分离和检出，并具适当的准确度和精密度。

在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明是合适的、分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定，或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱、水解及氧化的方法进行破坏，已研究可能的降解产物和降解途径，比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查，一般情况下峰纯度应>990。破坏实验按已批准的方案执行，各个破坏条件如下：

• 光照降解：将样品通过适宜的厚度平铺于称量瓶，置于光强度（4500lx±500lx）处的光源处，并每隔一段时间取样进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案执行。

• 高温固体降解：将样品通过适宜的厚度平铺于称量瓶，一般置于105℃（或在样品的熔点或分解点附近选择一个适合的温度点）的鼓风干燥箱内一段时间，并每隔一段时间取样进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案执行。

• 高湿降解：将样品通过适宜的厚度平铺于称量瓶，控制湿度75%或92.5%考察一段时间。并每隔一段时间取样进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案执行。

• 酸降解：将样品溶解后，采用一定浓度的盐酸溶液，在一定的温度条件下放置一段时间，每隔一段时间取出部分样品，用相同浓度和体积的碱液进行中和，用经验证的色谱方法进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案进行。

• 碱降解：将样品溶解后，采用一定浓度的氢氧化钠溶液，在一定的温度条件下放置一段时间，每隔一段时间取出部分样品，用相同浓度和体积的酸性溶液进行中和，用经验证的色谱方法进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案进行。

• 氧化降解：将样品溶解后，采用一定浓度的H2O2，在一定的温度条件下放置一定的时间，每隔一段时间取出部分样品，用经过验证的色谱方法进行测定，当样品约5%~10%被破坏时，可终止反应或根据已批准的方案执行。

• 高温液体降解：将样品溶解后，在一定的温度条件下水浴破坏一段时间，每隔一段时间取出部分样品进行检测，当约5%~10%的样品被破坏后可终止反应或根据已批准的方案执行。

在各降解条件下，主峰降低应在5%~10%以内；如果主峰降低超过10%，则应减少破坏或/和破坏溶液的浓度重新降解试验；若果样品在较强的条件下破坏后，仍然稳定，则停止试验，判断该条件对样品无明显影响；主峰峰纯度>990；质量平衡率评价指标：质量平衡率在90%~110%之间可认为此分析方法对杂质检出能力较好 。

3.1.3含量测定的专属性验证

含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量的准确结果。

在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质的试样比较测定结果。在杂质或降解产物不能获得的情况下，可通过与另一种具有较强分辨能力的方法（药典方法，经验证的独立方法）比对两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸，碱，水解及氧化），其破坏条件同杂质检查的专属性验证项下，得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成分的色谱峰中不包含其他成分。

3.1.4残留溶剂测定的专属性验证

空白溶液不干扰可能存在溶剂的出峰，对照品溶液及加标溶液中每个峰的分离度应不小于1.5，则确认本方法能够符合预期的使用要求。

3.2线性

线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量试验、含量测定等均需验证线性。

应在设计的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释或分别精密称样，制备一系列被测物质浓度进行测定，至少制备5个浓度，每个浓度至少进样2次，以测得的响应信号的平均值和被测物浓度进行线性回归计算。相关稀释r越接近1.000，表明越呈线性。

接受标准：除另有规定外相关系数r应>0.999，含量测定截距的绝对值≤100%浓度峰面积的2%；有关物质及残留溶剂截距应≤允许限度浓度峰面积的25%。

表1线性验证需涵盖的最低浓度范围

检测项目	需涵盖的最低浓度范围
原料药有关物质测定	至少标示量的20%~150%，推荐包含定量限浓度~限度的150%的浓度
原料药含量测定	至少标示量的50%~150%，推荐包含定量限浓度~限度的150%的浓度
杂质定量测定	范围应根据初步实测，拟定为规定限度的±20%。 如果含量测定与杂质检查同时进行，采用百分归一化法，则范围应为杂质规定限度的-20%至含量限度（或上限）的+20%。推荐包含LOQ~规定限度的+20%
含量测定（容量分析法）	确定相当于供试品溶液浓度的80%、100%、120%三个浓度，每个浓度配制三份溶液，每份溶液测定一次
残留溶剂	至少标示量的50%~150%（USP<1467>），推荐包含定量限浓度~限度的150%的浓度

3.2.1相对校正因子

参考线性项下各杂质与主成分的线性回归方程的斜率，采取以下公式计算各杂质相对主成分的相对校正因子f：

式中：

Ki：主成分线性回归方程的斜率；

K0：杂质线性回归方程的斜率；

f：相对校正因子。

标准规定：f>1.1或<0.9时，应带入相对校正因子对结果校正；若结果是被高估的，也可不带入相对校正因子对结果校正；0.9≤f≤1.1，无需带入相对校正因子对结果校正（即f以1.0计）

3.2.2线性范围

范围通常用于分析方法的测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量检测的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、杂质定量试验等。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精度结果和要求确定。要求见线性内容章节。

未完待续