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文献来源  作者信息 摘要 志贺氏菌(Shigella)是肠杆菌目肠杆菌科的一属，是一类革兰氏阴性、不活动、不产生孢子的杆状细菌。它主要侵袭人体肠道，导致人类肠道炎症性疾病（细菌性痢疾），每年引起约1.65亿人感染并造成超过20万人死亡。它的致病过程主要包括：1）通过胃肠屏障到达结肠；2）被结肠驻留的巨噬细胞吞噬并激活炎症小体；3）炎症小体诱导的巨噬细胞死亡，志贺氏菌得以逃逸；4）志贺氏菌侵入结肠上皮细胞并向邻近细胞扩散并引起上皮细胞死亡、溃疡、结肠内的液体增多产生脓血及黏液。显然，志贺氏菌避开免疫系统的监控并进行逃逸是其具备致病性的重要原因，但机制并不清楚。最近，德州西南医学中心的Neal M Alto教授团队发现了这一过程的具体机制，即：细菌感染过程中，宿主NK细胞（natural killer cell，自然杀伤细胞）通过分泌颗粒酶A（granzyme A，GZMA)，从而介导宿主上皮细胞中GSDMB的活化。而活化的N端GSDMB能够靶向到革兰氏阴性菌内膜上的心磷脂（CL），从而杀伤并清除细菌。然而，从巨噬细胞逃逸出来的志贺氏菌能够通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）将效应蛋白IpaH7.8导入宿主上皮细胞，并利用宿主26S蛋白酶体途径降解GSDMB，从而保护志贺氏菌免于NK细胞的杀伤。 研究背景 结果解读 既往研究表明，志贺氏菌能够通过Ⅲ型分泌系统（T3SS）将效应蛋白导入到宿主细胞中，从而帮助细菌逃避宿主免疫系统的监控。为了研究具体的逃避机制，作者通过质谱（mass spectrometry, MS)检测了宿主细胞裂解液中能与志贺氏菌效应蛋白家族IpaH成员（IpaH 2.5/4.5/7.8/9.8/2/4/5）结合的蛋白，发现IpaH7.8能与Gasdermin家族成员GSDMB、GSDMD结合。值得注意的是，GSDMB和GSDMD被报道能够介导细胞膜的穿孔作用从而使细胞以一种新的方式死亡，即细胞焦亡（pyroptosis）。 点击查看大图 为了进一步研究效应蛋白IpaH7.8与GSDMB蛋白之间的关系，作者在宿主细胞中过表达了志贺氏菌IpaH家族成员，并检测了宿主内源的GSDMB的表达。作者发现IpaH7.8能够降解GSDMB，而其他效应蛋白如IpaH1.4、IpaH4.5、IpaH9.8、IpaH1、IpaH2、IpaH3、IpaH4、IpaH5并不具备类似作用。接下来，作者检测了IpaH7.8对于Gasdermin家族其他成员的影响，发现IpaH7.8能够特异性的降解GSDMB，而对于GSDMC和GSDMD无影响。该结果说明：IpaH7.8特异性地靶向GSDMB并促进GSDMB的降解。由于IpaH7.8属于细菌中的E3泛素连接酶，因此作者构建了IpaH7.8的酶活突变体，发现相比于野生型IpaH7.8，酶活突变形式的IpaH7.8不能降解GSDMB。该结果表明，IpaH7.8对于GSDMB的降解作用依赖于其E3泛素连接酶的功能。由于大部分泛素相关的蛋白降解都依赖于蛋白酶体途径，因此作者进一步检测了IpaH7.8对于GSDMB降解的具体机制。作者使用了蛋白酶体降解途径的抑制剂MG132，发现MG132能够阻断IpaH7.8对于GSDMB的降解，说明IpaH7.8对于GSDMB的降解依赖于蛋白酶体途径。 点击查看大图 由于效应蛋白IpaH7.8属于E3泛素化连接酶，因此作者检测了IpaH7.8对于GSDMB的泛素化修饰作用。作者发现，IpaH7.8能够引起GSDMB的泛素化修饰，而IpaH7.8的酶活突变体不具备类似功能。已知泛素分子为包含76个氨基酸、大小约为8.6 kDa的小蛋白质，在真核生物中普遍存在且高度保守。因此，作者突变了泛素分子的赖氨酸位点（△K），发现IpaH7.8对于GSDMB的泛素化修饰显著削弱。并且，作者删除泛素的C端序列（△G）后，发现IpaH7介导的GSDMB泛素化被显著抑制。更重要的是，作者发现IpaH7.8主要介导了GSDMB的K48泛素化修饰，因为当突变掉泛素的K48位点（K48R）后，IpaH7.8介导的GSDMB泛素化被明显削弱。这个结果充分说明，IpaH7.8主要介导了GSDMB的K48泛素化修饰。接下来，作者检测了IpaH7.8对于Gasdermin家族其他蛋白成员的泛素化修饰作用，发现IpaH7.8主要介导GSDMB的泛素化修饰，而对于GSDMA、GSDMD、GSDME不存在类似效应，说明IpaH7.8是特异性地介导了GSDMB的K48泛素化修饰。 点击查看大图 既往研究表明，Gasdermin家族蛋白成员GSDMB、GSDMD、GSDME在激活后能够靶向哺乳动物的细胞膜，通过穿孔作用介导细胞膜的破损，从而引起细胞焦亡1。为了深入研究GSDMB在膜穿孔方面的作用，作者重构一种特殊的GSDMB蛋白(该蛋白插入了烟草蚀斑病毒蛋白酶（TEV-p）切割位点，能够人为控制GSDMB的活化）。作者在体外重构了哺乳动物细胞质膜的脂质体（PI，PI(4,5)P2，Sulfatides）,发现活化形式的GSDMD能结合哺乳动物细胞质膜的脂质体，而活化形式的GSDMB不具备类似功能。为了更好地模拟生理条件下哺乳动物细胞膜的组成，作者抽提了牛的肝细胞脂质体。活化形式的通过孵育GSDMB与牛的肝细胞脂质体，作者发现GSDMB确实不能结合哺乳动物的细胞膜成分。随后，作者检查了活化形式的GSDMB与大肠杆菌来源的脂质体之间的相互作用，发现活化形式的GSDMB能够结合大肠杆菌的细胞膜组分。
点击查看大图 大肠杆菌为革兰氏阴性菌，而革兰氏阴性菌的细胞膜主要由磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、心磷脂（cardiolipin，CL）、脂质A（di[3-deoxy-D-manno-octulosonyl]-lipid A，KLA）组成。因此作者检测了活化形式的GSDMB与这些细菌细胞膜成分之间的相互作用，发现活化形式的GSDMB主要结合细菌细胞膜中的心磷脂，与磷脂酰甘油、脂质A有较弱的结合，而与磷脂酰乙醇胺完全没有结合。进一步，作者发现活化形式的GSDMB与牛的肝细胞脂质体没有结合，但当肝细胞脂质体中混有心磷脂后，活化形式的GSDMB能够显著结合哺乳动物的细胞膜，进一步说明活化形式的GSDMB主要结合细菌细胞膜的心磷脂成分。
点击查看大图 既往研究表明，免疫细胞能够促进GSDMB的活化。因此，作者检测了NK细胞对于上皮细胞内GSDMB的活化作用，发现将上皮细胞与NK细胞孵育后，上皮细胞中的GSDMB能够发生切割活化，产生N端的GSDMB。由于活化的GSDMB能够靶向细菌的细胞膜，从而起到杀菌作用。因此，作者检测了NK细胞的杀菌效应，发现NK细胞能够显著性地杀伤志贺氏菌突变株（S.flexneri △7.8，突变掉IpaH7.8的效应株），而对于野生型的志贺氏菌没有影响。
由于NK细胞能够分泌颗粒酶，促进靶细胞的程序性细胞死亡2，因此作者检测了颗粒酶A（GZMA）对于GSDMB的切割效应。通过WB实验，作者发现颗粒酶A确实能够介导GSDMB的切割及随后的活化。作者进一步检查了颗粒酶A对于志贺氏菌的杀伤作用，发现颗粒酶A能够显著地抑制突变型志贺氏菌（S.flexneri △7.8）的增殖，而对野生型的志贺氏菌没有影响。该结果充分表明：颗粒酶A能够通过介导GSDMB的活化促进对志贺氏菌突变株的杀伤作用。而野生型的志贺氏菌能够通过IpaH7.8促进GSDMB的降解，从而逃避颗粒酶A的杀菌作用。
 结论 点评 以往研究表明，Gasdermin蛋白能够介导哺乳动物细胞膜的穿孔作用，促进哺乳动物细胞的焦亡。而这项工作打破了人们对Gasdermin蛋白功能的认识，即GSDMB能够靶向细菌细胞膜成分，介导细菌细胞膜的穿孔作用，从而起到杀菌效果。另外，该研究拓展了NK细胞杀菌的新机制，即通过分泌颗粒酶A促进上皮细胞中GSDMB的切割活化，通过GSDMB起到杀菌作用。值得注意的是，野生型的志贺氏菌能够降解GSDMB，从而逃逸宿主免疫细胞的监控，引起一系列的疾病发生。未来，可以针对这一机制研究相关的药物，为治疗志贺氏菌感染性疾病提供新的策略。 思维发散 参考文献 |
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