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当你的才华还撑不起你的野心时，请潜下心来，脚踏实地，跟着我们慢慢进步。不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了，通过文献速递这个栏目很幸运聚集了一些小伙伴携手共进，一起成长。 文献速递栏目通过简短介绍，扩充知识面，每天关注，希望你也能有所收获！ 本文于2019年2月发表在J Am Soc Nephrol上。文章题目是：Single-Cell RNA Sequencing Identifies Candidate Renal Resident Macrophage Gene Expression Signatures across Species 。文章主要测序了小鼠、大鼠、猪和人的肾脏组织中，T细胞、B细胞除外的CD45+免疫细胞。重新筛选出了肾脏resident macrophage新的表面marker，CD74和CD81。并用小鼠做了生物学验证。
1.普通分群 测序准备：取组织，1 mg/ml collagenase type I(1ml RPMI1640)+100 U/ml DNase I，37℃搅拌消化30min成单细胞悬液(小鼠)，分选出CD45+免疫细胞，去除T细胞(CD3e in mouse and pig, CD3 in rat and human),B细胞(B220 in mouse, CD45RA in rat, CD19 inhuman) 测序对象：在mouse, rat, pig, and human kidney tissue中分别测得 3013, 3935, 4671,2868个细胞, The mean reads 依次是 80508, 54456, 61638, 112080 分析手段：Unbiased hierarchical clustering and heatmap analysis using Seurat 无监督聚类图： 
细胞分型：通过参考文献，选已知marker来确定小鼠肾脏内部免疫细胞类型，neutrophils (Lcn2+), NK cells (Gzma+), ILCs (Il7r+), infiltrating macrophages (Ccr2+,Itgam+), resident macrophages (Adgre1+, Fcgr1+), dendritic cells (Snx22+, Batf3+) . Additional markers including Plac8, Lyz2, and Cebpb were used to identify infiltrating macrophages (Figure 1).23 以及小部分的 B cells (Cd79a+)
2.新的marker发现 聚焦Infiltrating or Resident Macrophages，使用Seurat包，做DEG分析，确定每一个类群中的表达差异性最大的基因，最终确定， uniquely expressed in Ly6c hi (Chil3, Plac8) and Ly6c lo (Fabp4, Ear2) infiltrating macrophages as well as embryonic-derived resident(C1qc, Cd81) macrophages ，如下图
实验步骤：使用FACS 分选 infiltrating (CD11bhi F4/80lo) and resident (CD11blo F4/80hi)，再用Fluidigm C1单细胞测序，进行PCA plots, violin plots, and heatmap分析。 分析结果：Fluidigm方法发现10X Genomics 发现的resident macrophage新的20个 marker中有13个是相match的，找了四种动物中Top4差异表达的基因(C1q, Cd81,Cd74,Apoe) 生物学验证：取小鼠肾脏组织的单细胞悬液，做流式分析。CD81和 CD74 is enhanced in resident macrophages (CD11blo F4/80hi) compared with infiltrating macrophages (CD11bhi F4/80lo)。C1q和Apoe对两群的区分不明显，被排除。
本文主要测序不同物种(小鼠、大鼠、猪、人)的肾脏组织中的CD45+免疫细胞，鉴定出CD74/CD81为resident macrophage的新marker。可能为其他细胞寻找新marker的或者鉴定未知类群的marker提供新思路。
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