流式实验对照设置之单阳对照

多色流式实验中，由于不同荧光素的发射波长的覆盖范围不同，可能产生重叠，对实验结果的数据分析造成一定干扰，我们通常会设置单阳管进行调节补偿。同时，单阳管还可以辅助我们调节通道电压，防止信号超出接收范围。

图示：常见荧光素的发射光谱

 如何设置单阳管

单阳管即单染管，是只添加一种荧光抗体的样本管。一般来说，实验panel有几种荧光，就需要设置几个单阳管。如：APC、PE、FITC的三色panel，需要设置三个单阳管。

制备单阳管的要求

1

单阳管和全染管的样本类型、荧光素要保持一致；

2

单阳管和全染管的样本处理要相同，如：全染管进行了固定破膜处理，单阳管即使是表面因子，也需要进行固定破膜；

3

单阳管上机的电压要和全染管保持一致；

4

单阳管要保证有足够的阳性细胞群。

单阳对照常见问题

问

目标marker表达量高，阴阳细胞分群明显，也需要设置单阳管吗？

答

如果panel的指标少，可以不用设单阳管，通过手动调节补偿，将细胞调整到横平竖直的状态即可。但是，如果panel的指标比较多，就必须都设置单阳管。

补偿前

补偿后

图示：FITC和PE之间存在荧光补偿，但CD4和CD8细胞分群明显，且整个panel只有三色，可以进行手动调节补偿。

问

某些marker的表达量比较低，单阳管的阳性群细胞不明显怎么办？

答

在设置单阳管的时候，我们会发现，一些低表达marker（Foxp3、IL-17A、IFN-γ等）的阳性群非常少，调节补偿时，软件不能正确识别，甚至识别不出阳性群细胞。这时，我们可以选择该样本高表达的一些marker（CD3、CD4等），用相同的荧光标记来代替低表达marker。

注意事项

►  进行流式配色时，请尽量选择光谱重叠少的荧光素，减少补偿

►  补偿值一般不会超过100%。如果出现超过100%的情况，可能是串联染料断裂导致；另外，补偿值不会出现负值，如果出现，则表示某些通道存在过补偿

►  软件自动调节完补偿，可以打开补偿面板，观察一下每个通道的补偿是否合理。若不合理，可以适当进行微调

►  为了更合理地圈出阴阳群，我们可以先根据FSC和SSC，圈出对应细胞群，这样更有利于调节补偿

综上，正确且合理地设置单阳管，更便于后续对流式实验结果进行分析。