一、单细胞测序学习scRNA-seq先了解一下Bulk RNA-seq
测序方法 二、单细胞测序流程测序流程 三、方法主要分为两大部分:定量与分离。
有限稀释技术(Limiting dilution technique)是利用移液管稀释分离细胞,这种方法的主要缺点是效率低下,成功率20%左右。 显微操作法(micromanipulation)是一种经典的方法,用于从少量细胞样本中提取细胞,如早期胚胎或未培养的微生物,缺点是耗时和低通量的。 流式细胞分选(FACS)广泛用于分离单个细胞,在悬浮状态下需要较大的起始体积(>10,000个细胞)。 激光捕获显微分离(LCM)是利用计算机辅助的激光系统将单个细胞从固体组织中分离出来。 微孔microwell 优势是可以与荧光触发细胞分离技术(FACS)结合,实现基于表面标记的细胞选择。对于想要分离特定细胞群的研究很有效;另外一个优势就是,可以对细胞进行拍照,帮助确定孔中是否存在损伤的或者重复的细胞。缺点是通量低,对每个细胞进行操作需要很大的工作量。 微流控(microfluidics)相对微孔,它的通量更高。缺点是只有10%的细胞能被捕获到,加入处理的细胞类型比较稀少,那么能被芯片捕获的就更少了,通量不高,成本高。 微液控制技术 例如Fluidigm's C1 微滴技术 是将单个细胞包裹在µl级别的液滴中,液滴被搭载到建库所用的酶上,每个微滴包含一个独特的条码(barcode),由那个被包装好的细胞产生的所有reads都被贴上了该条码,也是为了之后对于不同细胞reads的分辨。一般微滴技术的通量最大,查资料得知一秒能包装7万个以上的液滴,并且建库费用合适--0.05美元/细胞。但是高额测序费用又成了他的短板,鉴定出的一般只有一千多个差异转录本,覆盖度还是比较低的 这些单细胞分离方案具有各自的优点,可以根据研究目的来选择合适的分离方法。 四、分析流程黄色部分对于高通量数据的处理都是差不多的流程; 五、应用单细胞技术揭示细胞的异质性、细胞分化、发育过程中不同的生理状态下的变化、疾病发生病变等生物学过程。 单细胞转录组测序主要应用方向 1.大规模细胞图谱构建 特定组织裂解后通过单细胞测序获得单细胞转录组图谱,并基于每个细胞基因表达谱数据进行细胞类型聚类,分析研究复杂器官中不同细胞亚型的功能,了解细胞间的差异以及各种细胞群体间的协作关系。 2.细胞亚群细化&稀有细胞类型鉴定 在单细胞类型聚类基础上,依照已知细胞类型标志基因表达情况和新基因表达情况,进一步细分细胞类型并发现新的细胞亚群,分析各个小亚群细胞差异,小亚群细胞和稀有细胞类型在生物学过程参与的功能。 3.肿瘤方向研究
4.干细胞发育及分化研究 通过单细胞测序全面解析干细胞异质性,鉴定干细胞分化不同阶段的不同类型分化过程细胞,鉴定不同亚型干细胞Marker基因,绘制干细胞发育和分化轨迹,解析干细胞发育和分化的分子机理。 5.免疫方向研究
6.神经科学研究 研究神经元细胞分群情况以及不同神经元细胞类型的异质性,了解神经干细胞-神经元细胞分化过程的分子调控机制。 7.发育生物学
8.生物标志物/疾病分型 发现并鉴定异常增殖的细胞类型,结合传统病理学特征,辅助疾病分型 参考: |
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