 作者：孔志坚，南京农业大学博士在读，主要研究堆肥过程中的物质转化机制。竞知向学、厚德笃行。 摘要 保护宿主免受病原体侵袭的微生物在自然界中普遍存在，这种保护机制包括人类在内的动植物物种在自然界中已被广泛研究发现，它为人类和动植物物种提供了一条强有力的免疫防线。研究发现在线虫宿主中发生了共同进化的一个具有宿主保护特性的微生物(粪肠球菌)和一个病原体(金黄色葡萄球菌)，并且病原体作为适应防御微生物而产生的自身保护机制，驱动了其毒力的进化。通过基因组和表型分析，发现病原体产生较少的铁载体，一方面降低了防御微生物的适应性，另一方面致使自身的毒力下降。这些结果表明，防御微生物可以影响病原体毒力的进化，抗病机制可以决定毒力进化的方向。 假说 一、病原体抗性与毒力呈正相关，防御性微生物将导致病原体毒力的增加(图1 a)，例如，病原体可以通过更快的生长速率或诱导炎症来增强与防御微生物的竞争能力，这两者都对宿主有害。 二、病原体抗性和毒力特性之间存在权衡，例如，抗病性代价很高，并且减缓了病原体的生长速度，那么防御性微生物将驱动较低的毒力水平(图1 b)。 图1 病原体毒力机制与微生物介导的防御能力之间可能存在的关系 结果与分析 微生物介导防御 由图2可知在进化实验之前，粪肠球菌在与金黄色葡萄球菌在线虫寄主内培养24小时后，发现粪肠球菌提供线虫寄主的好处(暴露于病原体后的寄主死亡率降低12%)远远大于其对宿主的损害(在防御微生物暴露24h后死亡率为0.69%)。有趣的是，我们发现粪肠球菌在宿主感染金黄色葡萄球菌时达到了更高的种群规模，这表明，虽然粪肠球菌对于金黄色葡萄球菌具有危害性，但这种病原体反过来会以一种促进防御微生物生长的方式改变环境。因此，这些数据揭示了防御性微生物与病原体之间的强烈对抗关系，从而使一个物种受益，另一个物种受到损害。 图2 原始细菌毒力和宿主内细菌种群大小 病原菌毒力 为了测试防御性微生物是否能影响病原体的毒力进化，我们在非进化的、基因同质的线虫种群中共传代10代，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(共进化处理)和单独传代，金黄色葡萄球菌(单次进化处理)。这两个处理都由五个复制种群组成，它们都是从每个细菌物种的同一克隆开始的，因此进化是全新的。每一传代时间为24小时，并从10只死宿主的混合肠道中收集10个金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的菌落，并用于下一代。 图3 协同进化实验 我们发现，与防御性微生物的实验协同进化促使所有复制种群的病原体毒力降低，超过了单一进化处理中所见的水平。这种致病菌毒力的降低与病原体体外生长速率的降低有关，这支持了毒力和生长率之间的联系。尽管生长速度有所下降，但在受原始粪肠菌保护的宿主中，共同进化的金黄色葡萄球菌的活菌数明显高于祖先或单一进化种群。这一结果表明，这些病原体已经适应了与防御微生物的相互作用，并且病原体的毒力与对微生物介导的防御的抵抗力之间存在一种权衡，从而支持了我们在图中(图1 b)的第二种假设。 图4病原菌毒力和适应性 铁载体的产生 我们提出，支撑这一变化的机制是致病菌的毒力与生长速度涉及微生物结合和摄取铁产生的铁载体的化合物的量有关。铁限制的寄主环境中，铁载体影响病原菌的生长速度，影响毒力。重要的是，铁载体是一种“公共利益物质”，因此可以被邻近的微型生物利用。理论认为，无关病原体之间对宿主资源的竞争是为了减少公益生产，从而降低毒力，这得到了实验和自然界感染研究的支持。重要的是，当一种病原体被一种防御性微生物所利用时，我们假设会有更强的针对公益生产的选择，并且具有如此的毒性，因为防御微生物会伤害生产者。这一现有理论的扩展将与我们的研究结果一致，即微生物保护宿主的病原体毒力和生长速率随着时间的推移而降低，并将进一步解释祖先金黄色葡萄球菌对粪肠球菌的益处。 为了确定防御性微生物是否导致致病菌毒力降低，作为选择减少铁载体的产生，我们测定了铁载体的活性，并将其与致病菌的毒力进行了比较。通过体外测定金黄色葡萄球菌种群产生的铁载体浓度，我们发现联合进化处理产生的金黄色葡萄球菌数量最少，并且铁载体的产生与病原菌的毒力呈正相关。 图5 铁载体的生产量 分子进化 考虑到在没有粪肠球菌的情况下，由共同进化的金黄色葡萄球菌产生的铁载体较少，我们的结论是这种变化是构成性的。为了证实这是进化变化的结果，我们在进化实验结束时对原始种群和金黄色葡萄球菌种群进行了全基因组测序。没有单一突变在任何复制群体之间共享，表明同一表型在每种处理中多次独立进化。病原菌的单独进化与共同进化时铁载体产生变少，这两种处理进化的突变都可能与铁载体的产生途径有关。病原菌中共同进化时铁载体的产生途径的突变频率要高于单独进化时铁载体产生途径的突变。具体来说，在每个共同进化的病原体群体中，至少有一个非同义突变已经传播到大于80%的频率，可能与铁载体的产生有关。相比之下，一个进化复制群体中只有一个突变达到50%。这种突变分布表明，防御性微生物对金黄色葡萄球菌种群进行了强有力的选择，从而导致了选择性的清除。 图6 分子进化。共进化和单一进化中的非同义突变计数在种群中按一定频率复制(40个随机抽样克隆的百分比)。 铁载体对防御性微生物适应性的影响 为了确定铁载体是不是可以被防御性微生物利用的公共物质，本研究做了不同外援添加铁载体的浓度下，原始防御微生物的体外生长速度。在自然病原体产生的铁载体范围内，铁载体的浓度与粪肠菌生长率呈正相关。然后，我们发现防御微生物的适应度直接受金黄色葡萄球菌产生铁载体的进化变化的影响。在这里，当与共同进化的金黄色葡萄球菌共同培养时，粪便肠球菌与祖先病原体的相互作用(与独立生长相比)消失了，从而产生了最少的铁载体。为了检验铁载体产量的变化是否足以解释这些差异，我们检测了当与祖先和进化的金黄色葡萄球菌共同培养时，剩余铁对粪肠球菌健康的影响。在过剩铁的情况下，铁载体的生产应该受到抑制。过剩的铁消除了不同致病菌对防御微生物健康状况的影响。证实了铁载体是一种“公共利益物质”，作为病原菌适应微生物介导的防御的机制。 图7 铁载体对防御性微生物适应度的影响 总结与展望 防御微生物和病原体的共同进化推动了致病菌毒力的进化，以此作为对抗微生物介导防御的病原体抗性的一种交换。通过在线虫种群中共同进化的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌，我们发现来自所有复制种群的病原体实现产生较少的铁载体的进化。作为这种适应的自身保护机制，所有共同进化的病原体种群的毒力明显低于祖先和单一进化群体，因为在没有防御微生物的情况下，铁载体的产量降低了它们的生长速度。鉴于铁载体被致病菌广泛使用，减少铁载体的产生可能是对与宿主微生物区系成员相互作用的一种常见的适应，并可能有助于解释自然界病原体种群中存在铁载体突变体。我们已经证明了防御微生物和病原体之间进化相互作用的潜力，并强调了毒性的重要含义。了解病原菌对微生物介导的防御的潜在抗性机制对于解释自然界疾病严重程度的变化和预测应用疾病控制下的毒力进化方向至关重要。
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