【原】CRISPR/Cas9文库筛选技术原理

CRISPR/Cas9技术凭借着设计简便、操作容易、效率高成为目前应用最广泛的基因编辑技术在2019年的国自然中标项目中，涉及CRISPR/Cas9的相关研究的中标项目共有32项，总资助金额为1204万元，占CRISPR总项目的一半以上，可以说表现也是相当亮眼了。

　　今年4月份《Nature》上发表文章，利用CRISPR文库高通量地在324种细胞中针对18,009个基因进行筛选研究，发现了1459种癌症生存相关的基因，并通过后续的深度分析和挖掘，罗列出最有希望成为药物靶标的基因，为癌症治疗药物的研究提供了方向。

　　相比与RNAi文库技术，CRISPR技术能够彻底破坏基因的功能，且脱靶性低于RNAi。CRISPR的技术既可以用于Loss-of-Function (如CRISPR KO，CRISPRi)，又可以用于Gain-of-Function(如CRISPRa)的筛选研究，功能更加强大。

　　CRISPR/Cas9文库筛选技术

　　利用CRISPR/Cas9技术建立哺乳动物全基因组突变库或者与某类功能相关的基因突变体库，通过功能性筛选和富集以及随后的PCR扩增和深度测序分析，发掘与筛选表型相关的基因，称为CRISPR/Cas9文库筛选。

　　CRISPR/Cas9文库筛选应用方向

　　一、药物靶点确定与验证

　　CRISPR/Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。

　　比如这篇发表在Science上的文章，研究人员利用CRISPR/Cas9文库对人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

　　二、基因环路上下游调控机制分析

　　CRISPR/Cas9文库筛选技术对于基因组中的调控元件也同样有效，利用这种方法可以对基因环路上下游调控机制进行分析。

　　比如这篇发布在Nature biotechnology上的文章，科研人员对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查，共鉴定出3个增强元件与ERα的相关;3个增强元件与p53功能相关联的3个增强子，其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。

　　三、Long noncoding RNA作用机制分析

　　CRISPR/Cas9文库的建立可以实现基因组的大规模筛选，比如为了对非编码基因的功能进行验证，下面这篇发布在Nature biotechnology上的文章，提出构建了psgRNAs文库的方法，这种成对的sgRNA可在同一基因中造成两处断裂，形成大片段缺失，从而影响表型变化，成为研究非编码基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文库，对人源肝癌细胞系Huh7.5OC进行基因组的700个lncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验，最终筛选到51个lncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。

　　实验流程

　　CRISPR/Cas9文库筛选主要步骤如下图：

　　现在许多实验室，公司及临床项目已经开始对CRISPR/Cas9技术进行应用，比如：利用其进行信号通路相关基因的寻找，药物靶点筛选，药物原发性研究以及基因治疗等。