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by LHY 知识点积累 实验结果 1.乳腺癌CSC中TSPAN8表达上调 作者对来源于乳腺癌患者的原始细胞及其相应培养的贴壁细胞（nCSC）进行微阵分析，对所有33种四跨膜蛋白表达水平分析后发现，与nCSC相比，CSC中TSPAN1, TSPAN15, TSPAN8, TSPAN11, TSPAN29和TSPAN27表达水平更高，其中TSPAN8表达水平明显增高。作者又通过免疫荧光分析进一步证实了TSPAN8和ALDHA1（CSC标记物）在原始乳腺癌细胞中过表达。为了证实TSPAN8是否为CSC标记物，作者用流式将来自3名乳腺癌患者的原始乳腺癌细胞中TSPAN8高表达（TS ）与低表达（TS-）的细胞分开后发现，TSPAN8高表达的细胞中NANOG和OCT4（参与干细胞多能状态维持的转录因子）表达上调，rtPCR和免疫印迹分析表明TSPAN8，NANOG，SOX2和ALDHA1的转录和蛋白质表达水平在原始细胞中更高。分析乳腺癌细胞中CD44 /CD24-和TS 的关系，作者发现TS 细胞中CD44 / CD24-细胞的百分比明显高于TS-细胞中的百分比，乳腺癌细胞的CD44 / CD24-亚群中有66.45±1.63％是TS 细胞。这些结果支持TSPAN8与癌症细胞干性相关。此外，作者对不同病理类型进行微阵分析，发现TSPAN8在TNBC中高表达，在luminal型低表达，并且其表达水平与OS负相关。接下来，作者对一组人类乳腺癌标本进行了免疫组织化学染色（IHC）分析发现TSPAN8表达与乳腺癌患者的不良预后及其治疗抗性正相关。 TSPAN8过表达促进了正常培养条件以及阿霉素、紫杉醇处理条件下细胞的生长，而TSPAN8的消耗则导致相反的结果。相似的是，来自患者肿瘤组织中TS 细胞对紫杉醇和阿霉素诱导的细胞毒性表现出显著增强的抗性。此外，FACS和免疫印迹分析显示，PTX和ADR在TS 和TS-乳腺癌细胞中均增加了TSPAN8的表达。这些结果表明，TSPAN8促进了癌细胞的干性和对化疗药物的抵抗性。 3.TSPAN8通过活化Hedgehog信号通路促进癌细胞的干性 作者通过在MCF7细胞系中过表达TSPAN8，发现其显著增加了Hh信号通路中PTCH1，GLI和SHH的mRNA表达。蛋白质水平上也有类似结果。相反，TSPAN8消耗减少了这些基因的转录和蛋白质表达，并阻止了SHH剂量依赖性上调GLI1的表达。TSPAN8过表达增强了SMO磷酸化和GLI1的转录活性。当使用Hh信号通路抑制剂可降低TSPAN8过表达对上述基因转录和蛋白质表达水平的影响，并降低了癌细胞的生长和CD44 / CD24-癌细胞的数量。 4.TSPAN8通过募集ATXN3来稳定PTCH1的表达 作者通过免疫共沉淀发现TSPAN8与SHH、PTCH1相互作用。GST下拉试验表明， GST-TSPAN8直接与His-PTCH1-CTD结合，但不与His-SHH结合。此外，TSPAN8在293T细胞中的过表达增加了SHH和PTCH1的表达水平，促进了SHH和PTCH1的共定位。用放线菌素D处理MCF-7细胞可阻断SHH和PTCH1基因的转录，但并不能消除TSPAN8诱导的SHH和PTCH1蛋白的上调。与此发现一致，用蛋白质合成抑制剂CHX处理MCF-7细胞表明，TSPAN8过表达通过延长两种蛋白质的半衰期来稳定PTCH1和SHH表达。相反，TSPAN8耗竭可降低PTCH1和SHH表达，并缩短其半衰期。这些结果表明，TSPAN8通过防止PTCH1和SHH依赖蛋白酶体的降解来增强其稳定性。作者对免疫沉淀的TSPAN8进行了质谱分析，发现TSPAN8促进了ATXN3与PTCH1的结合，从而减少了PTCH1的降解。接下来，作者研究了TSPAN8对PTCH1泛素化的调节。TSPAN8或ATXN3的过表达降低了PTCH1的多聚泛素化，而TSPAN8和ATXN3的共表达则进一步降低了PTCH1的多聚泛素化作用。相反，ATXN3的消耗增加了PTCH1的多泛素化作用，并减轻了TSPAN8对PTCH1的多泛素化作用的抑制作用。因此TSPAN8通过促进ATXN3与PTCH1的结合来稳定PTCH1的表达，从而导致PTCH1的去泛素化。 5.TSPAN8促进SHH诱导的SMO磷酸化 作者发现TSPAN8的过表达增强了SHH诱导的GRK2蛋白激酶与PTCH1和SMO的结合、SMO的磷酸化以及MCF-7细胞中GLI1的转录活性。然而，这些增加被ATXN3耗竭所废止。GRK2抑制剂盐酸帕罗西汀和GSK180736A阻断了TSPAN8诱导的SMO磷酸化，这提示TSPAN8增强了GRK2与PTCH1和SMO的结合，从而导致SMO磷酸化增强。ATXN3的消耗降低TSPAN8过表达增强的MCF7球的形成效率和对化疗药物的耐药性。这些结果表明，TSPAN8的过表达和ATXN3介导的PTCH1的表达促进了GRK2与PTCH1和SMO的结合，从而增强了SMO的磷酸化、GLI1转录活性以及癌细胞干性和对化学治疗剂的抗性。 作者通过动物实验发现注射了TS 细胞的小鼠其肿瘤迅速生长，TS 细胞在干细胞比率远高于TS-细胞。为了进一步检查TSPAN8和ATXN3调控的Hh信号在肿瘤形成中的作用，作者设立了ATXN3 shRNA表达及不表达的对照组，向小鼠注射MDA-MB-231细胞，发现 TSPAN8的过表达增加了肿瘤形成能力和干细胞频率，并缩短了小鼠存活时间，而TSPAN8耗竭有相反的结果，这种促进效应可被ATXN3 shRNA的表达所抑制。IHC表明TSPAN8表达水平与Ki67，PTCH1，GLI1，ALDHA1和NANOG的水平相关，并且ATXN3 shRNA的表达降低了TSPAN8过表达的影响。肿瘤标本的免疫印迹分析进一步证实了上述发现。因此TSPAN8通过ATXN3介导的PTCH1稳定表达来促进Hh信号通路传导和肿瘤的发生。 7.TSPAN8与PTCH1，SHH和ATXN3表达相关 作者对90个乳腺癌标本进行IHC染色，发现肿瘤组织中TSPAN8的表达高于相邻的肿瘤组织中的表达。TSPAN8和SHH、PTCH1和ATXN3表达上存在正相关，并具有统计学意义。高水平的ATXN3表达与乳腺癌患者的不良预后相关。综上，TSPAN8与ATXN3一起通过增强PTCH1和SHH的表达来促进Hh信号通路和乳腺癌的进展。 总结与思考 |
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