《ANN ONCOL》：识别高肿瘤突变负荷下的免疫治疗无应答（IF = 32.976）

    肿瘤突变负荷（TMB）反映了癌症突变基因的频率，较高的TMB会产生更多的新抗原，从而增加T细胞识别的机会，有利于免疫系统清除癌细胞。但高TMB的病人也有可能对免疫治疗不应答，该文作者立足高肿瘤突变负荷的肺腺癌，通过KEAP1驱动的共突变识别免疫治疗无应答的癌症患者。

一、摘要

    免疫检查点抑制剂(ICIs)在肺腺癌中表现出显著的总体生存(OS)获益。然而，无论PD-L1的表达和TMB如何，患者间的免疫治疗效果都具有显著异质性。在接受化疗的肺腺癌患者中，KEAP1突变与较短的生存期有关。作者假设KEAP1突变与其他突变共存和排斥的相互作用模式可以识别肺腺癌患者对免疫治疗无反应性，并基于ICI治疗的肺腺癌患者的基因组数据，在KEAP1突变的基础上，确定了其他三个可能与免疫治疗疗效降低相关的突变基因(PBRM1、SMARCA4和STK11)。同时，这种不良预后的结果与共突变的性质无关，共突变肿瘤组的生存率均低于单一突变和野生型肿瘤组；且在高TMB的肺腺癌中，共突变导致不良预后的影响依然存在。共突变组和野生型肿瘤组在核心免疫特征、T细胞受体、T辅助细胞和免疫调节基因方面存在显著的免疫基因组学差异。

    这项研究表明，特定基因共突变是肺腺癌的一种亚型特征，即伴有高TMB但对免疫治疗没有反应的亚型，其表现出的免疫“冷”微环境可能是该病进展的重要原因。

二、流程图

①MSKCC数据库分析得到肺腺癌中与KEAP1协同的突变基因，排除互斥的突变基因；

②III期OAK试验的bNGS队列中通过OS的单因素COX分析选取有预后价值的突变基因；

③在I/III期POPLAR/OAK试验的bNGS队列中进行预后与药物反应分析；

④通过tNGS队列验证上述结果；

⑤共突变的肺腺癌突变负荷与肿瘤新抗原、免疫基因组学分析；

注意：本文中作者所用的bNGS和tNGS队列均是接受了ICI治疗的患者队列。

三、结果解读

1、识别与KEAP1突变协同或互斥的突变基因

    作者利用MSKCC数据库中的肺腺癌队列，识别与KEAP1突变表现出最紧密的协同/互斥关系的基因，如下图A、B，通过有无KEAP1突变将肺腺癌队列分为野生肿瘤型组（WT）和突变组（Mut），发现野生型肿瘤组中EGFR突变较显著，属于和KEAP1的互斥突变；而突变组中KRAS、PBRM1、SMARCA4和STK11突变较显著，属于和KEAP1的协同突变。

    随后，在III期OAK（即III期临床）试验中，利用bNGS（基于血液的高通量测序）队列，对以上4个共突变基因进行关于OS的单因素COX分析，如下图C，除了KEAP1，作者证实了STK11突变可能与死亡风险增加之间存在联系。此外，作者还确定了SWI/SNF染色质重塑复合物的两个中心组分PBRM1和SMARCA4是生存结局的潜在预测因子，但PBRM1和SMARCA4作为单一变量无显著统计学意义。

    KRAS由于无显著统计学意义被排除，同样作者也没有观察到其他KEAP1共突变基因和OS之间有任何关联，如下图D。

    之后，基于II/III期POPLAR/OAK（II/III期临床）试验的bNGS队列，作者又探究了独立于突变性质的的情况下，KEAP1、STK11、PBRM1和SMARCA4之间至少两个基因的共突变组合是否比单突变提高了生存预测能力。结果如下图A所示，共突变组（CoMut）的肿瘤患者与野生型肿瘤组(WT)相比，生存期明显缩短，而单突变(SM)肿瘤的预后中等，并且该结果在较大样本的队列中更为显著，如下图B所示。

    同时，上述结果在多变量Cox回归模型中得到证实，如下图C所示；且最佳确认总缓解(BCOR)和无进展生存期(PFS)所呈现的结果与OS一致，如下图D所示。

2、模型在tNGS队列中的独立验证

    在验证队列(tNGS，N = 289)中，与SM组和WT组肿瘤相比，CoMut组的生存期明显较短，如下图A所示。也在多变量Cox回归模型中证实了该结果，如下图B所示。与之前的bNGS队列得到的结果相比，作者在tNGS（基于组织的高通量测序）队列中发现的唯一差异是tNGS队列中的SM组肿瘤的生存期与WT组相当，因此表明单突变基因可能无法预测免疫检查点抑制剂治疗的疗效。

3、肿瘤的突变负荷、新的抗原和突变的特征

    首先，作者假设共突变的不良预后与TMB和/或肿瘤新抗原负荷(TNL)有关，即假设共突变肿瘤组是低TMB，结果发现与之相反，共突变组呈现出高TMB，如下图A、B所示；但共突变组所表现出的预后依然与低TMB肿瘤应该表现出的预后一致，皆是不良预后，如下图C、D所示。而在TCGA研究中，与WT肿瘤相比，CoMut和SM组肺腺癌的特征是TNL有升高趋势，这与高TMB的表现相符合。

    作者测试了模型（KEAP1、PBRM1、SMARCA4和STK11）与引起高TMB患者基因组不稳定的突变特征之间的关系。APOBEC（载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽 ）和吸烟阳性病例的TMB显著高于阴性病例，而且吸烟是与OS相关的唯一特征。尽管在tNGS队列中模型的突变基因与这些因素没有达到完全显著的程度，在所选基因组背景下，总体突变特征相当如下图E、F。所以这些数据表明，CoMut模型和免疫治疗疗效之间的联系与基因组不稳定性的潜在突变过程无关。简而言之，4种基因的突变表现与APOBEC、吸烟等特征无显著联系。

4、携带共突变的肺腺癌的免疫基因组学特征

    作者利用TCGA数据库研究共突变肺腺癌的免疫基因组学特征，确定6种免疫亚型（C1：伤口愈合；C2：IFN-γ显性；C3：炎症；C4：淋巴细胞耗竭；C5：免疫静止；C6：TGF-β显性）的分布在3组（WT、SM、CoMut）之间是否存在差异，如下图A所示。与野生型肿瘤相比，CoMut组C1亚型更广泛的代表；相反，C3亚型在CoMut组中不太常见。而C3在之前的胰腺癌研究中预后良好，而C1的特征是预后不良。

    接下来，作者深入探究了突变分组和用于癌症免疫分类的核心免疫标志（巨噬细胞/单核细胞、淋巴细胞浸润、TGF-β反应、IFN-γ反应、伤口愈合和辅助增殖标志）之间的关系，如下图B所示。CoMut组的伤口愈合特征评分高于WT组，而WT亚组的IFN-γ反应、淋巴细胞和巨噬细胞/单核细胞浸润评分更高。核心免疫标记在各种肿瘤类型中具有不同的显著性，并且在某些情况下具有不同的显著性。而在肺腺癌中，巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞浸润与较长的生存期相关，而伤口愈合标志的生存结局较差，如下图C所示。

    CoMut组中T细胞受体(TCR)丰度和多样性低于WT组，如下图D所示。Th1基因在CoMut肿瘤中表达不显著，如下图E所示。最后，在CoMut组中观察到免疫调节基因的较低表达，其中包括PD-L1，如下图F所示。然而，在OAK试验中蛋白水平的PD-L1表达数据未发现分组之间的差异。总的来说，CoMut组的免疫基因组框架与其在免疫治疗期间的临床过程是一致的。

四、小结

    作者基于KEAP1突变的肺腺癌，第1部分从差异分析到ICI治疗的预后分析、从生存分析到单因素和多因素的COX分析，筛选出了共突变基因并以此分组，第2部分通过其他队列验证了上述结果，第3部分把分组结合突变负荷和新抗原，最后第4部分通过分组探究免疫基因组学特征。该文献虽然篇幅不长，但整体思路环环相扣又层层递进，细细品味又耐人寻味，高分文章的不仅思路新奇，而且行文严谨，有诸多可学之处，如果有兴趣的小伙伴可以下载原文阅读，我们一起学习进步~

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参考：Marinelli D, Mazzotta M, Scalera S, Terrenato I, Sperati F, D'Ambrosio L, Pallocca M, Corleone G, Krasniqi E, Pizzuti L, Barba M, Carpano S, Vici P, Filetti M, Giusti R, Vecchione A, Occhipinti M, Gelibter A, Botticelli A, De Nicola F, Ciuffreda L, Goeman F, Gallo E, Visca P, Pescarmona E, Fanciulli M, De Maria R, Marchetti P, Ciliberto G, Maugeri-Saccà M. KEAP1-driven co-mutations in lung adenocarcinoma unresponsive to immunotherapy despite high tumor mutational burden. Ann Oncol. 2020 Dec;31(12):1746-1754. doi: 10.1016/j.annonc.2020.08.2105. Epub 2020 Aug 28. PMID: 32866624.