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目前，体外定向进化已被广泛用于筛选具有改善的结合或催化特性的核酸分子。由于蛋白质在生物学中发挥着重要作用，且已广泛应用于诊断、制药和工业等领域，因此，学者们对蛋白质体外筛选和定向进化方法的开发产生了极大的兴趣。然而，开发有效的蛋白质进化方法面临的主要障碍是：在蛋白质翻译后难以恢复编码蛋白质序列的信息。 噬菌体展示、质粒展示技术等可通过在体内转录和翻译解决上述难题，通过这些技术所得的蛋白能保持与编码核酸的物理连接，并被回收用于扩增和进一步筛选。然而，此类技术受限于生成文库的复杂性，如在噬菌体展示技术中，构建文库和筛选涉及细胞转染，文库容量受转染效率的限制(通常被限制在109~1010)，降低了文库筛选效率。设计体外蛋白质筛选方案的困难在于，虽然体外筛选涉及筛选和扩增的迭代循环，但没有简单的方法来扩增已被筛选的功能性蛋白质分子。1990s，研究者们开发了核糖体展示技术，该方法的优点是完全在体外开展，并能获得更大的文库(＞1012)；然而体外筛选必须在保持核糖体-mRNA-peptide三元复合物完整性的前提下进行。可喜的是，随着科学家们不断的探索，一种更简单、更强大的体外筛选方法——mRNA展示技术应运而生。它是否会带来惊喜呢？图1.中心法则示意图 在介绍mRNA展示技术前，我们先来回顾一个重要概念——中心法则，即DNA通过RNA将遗传信息传递给蛋白质，从而完成遗传信息的转录/翻译的过程；也可指DNA间完成遗传信息的传递，从而实现DNA复制的过程。DNA在进入细胞核后将遗传信息传递给信使RNA，即mRNA，完成“转录”；mRNA离开细胞核并将携带的遗传物质到达制造蛋白质的场所——由rRNA与蛋白质构成的核糖体，此时，tRNA携带氨基酸到达核糖体中，后者按照mRNA携带的遗传信息将氨基酸合成蛋白质，这一过程称为“翻译”。理论上，我们可以通过人工编辑mRNA合成几乎任何蛋白质。中心法则是所有具有细胞结构的生物所遵循的法则。只要掌握了中心法则，mRNA展示技术的基本原理也能轻而易举地理解。mRNA展示技术又称mRNA-蛋白质融合体展示技术，是将基因型（mRNA）与表型（蛋白质）融合的体外多肽/蛋白质筛选技术，可用于生物分子配体的发现和相互作用分析。mRNA展示技术主要有7大步骤，包括：(1) 构建编码mRNA的DNA库。构建大容量随机DNA库用于编码mRNA，并对DNA进行特殊加工：在5’端添加T7聚合酶启动子、翻译增强子、翻译起始密码子等序列；3’端不加终止密码子，并添加亲和纯化标签；(2) RNA转录并与嘌呤霉素连接。在体外利用T7聚合酶将DNA转录成mRNA后，通过如寡核苷酸等连接子将mRNA的3’端和嘌呤霉素结合；(3) 体外翻译，形成mRNA-肽复合物。核糖体以带有嘌呤霉素的mRNA为模板进行体外翻译，并生成新肽链，嘌呤霉素进入核糖体并中止体外翻译，使mRNA和新生肽链形成mRNA-肽复合物，并从含核糖体及其他成分的反应液中纯化出来；(4) cDNA逆转录，形成cDNA/mRNA-肽复合物。通过逆转录实时聚合酶链(RT-PCR)反应，对mRNA进行逆转录，从而得到与蛋白质结合mRNA的互补DNA链，即cDNA，生成cDNA/mRNA-肽复合物，以稳定核酸成分并加速筛选后基因信息的恢复；(5) 筛选，分离。采用ELISA、磁珠法等，将目标靶点固定化于固相载体上，筛选出可特异性结合目标靶点的cDNA/mRNA-蛋白质融合体，并将无法结合的cDNA/mRNA-蛋白质融合体分离；(6) 扩增，获得下一轮筛选的DNA模板。在高pH下将cDNA/mRNA-蛋白质融合体中的mRNA水解，释放cDNA链，并对cDNA进行PCR扩增，为下一轮筛选提供DNA模板或测序，这一阶段利用易错PCR可增加以扩增DNA为中心的序列多样性。(7)富集，得到目标蛋白和基因序列。依靠DNA库的多样性和靶点作用，在进行4～10轮筛选后，可富集高亲和力结合靶点的多肽序列。
图2.mRNA展示技术体外筛选循环流程 mRNA展示技术的核心要素为嘌呤霉素，核心步骤是通过嘌呤霉素形成mRNA-蛋白质复合物。嘌呤霉素为一种蛋白质合成抑制剂，由于具有与酪氨酰-tRNA末端相似的结构，因此能与氨基酸结合。然而，与酪氨酰-tRNA中的可裂解酯键相比，嘌呤霉素具有不可水解的酰胺键，会干扰翻译，并导致翻译产物过早释放。
图3.嘌呤霉素和氨酰tRNA结构对照 通过寡核苷酸连接子将嘌呤霉素与mRNA的3’端连接，通过核糖体的体外翻译作用，以带有嘌呤霉素的mRNA为模板，进行编码序列并翻译成新生肽链。此时，嘌呤霉素会与氨酰化的tRNA发生竞争性抑制，前者进入核糖体的A位点，通过结构上的O-甲基酪氨酸会与新生肽链的C端氨基酸形成稳定的酰胺键，实现共价连接，生成mRNA-肽复合物，并进行亲和纯化，以除掉反应液中核糖体等其他成分。
图4.mRNA-肽复合物形成过程 然而，需要注意的是，此时纯化出来的复合物还不能用于筛选。这主要是因为，mRNA在筛选过程易出现降解，且RNA中的二、三级结构会与靶点发生竞争性结合，产生干扰。为此，mRNA展示技术的创始人Szostak于2000年提出了相应的解决办法：对mRNA进行逆转录生成cDNA，形成cDNA/mRNA-肽复合物来稳定核酸。其中，cDNA通过RT-PCR得到。使用cDNA/mRNA-肽复合物可加速筛选后基因信息的恢复，且限制较小。mRNA展示技术发明最初并不包含cDNA逆转录，在1997-2006年间，研究人员不断对mRNA基础方法进行优化，而自2006年开始，该项技术开始不断在高通量筛选方面应用：1997年，Jack W.Szostak和Richard W.Roberts创造性地将嘌呤霉素共价连接在mRNA片段的3'端，实现了mRNA与多肽的连接。最初，该技术采用夹板法，通过寡核苷酸连接子实现嘌呤霉素与mRNA的连接，但连接效率较低，mRNA-肽复合物的形成率仅1%~10%。2000年，Szostak在原有mRNA展示技术的基础上，将mRNA逆转录为cDNA，解决了RNA二、三级结构产生的干扰问题，并将mRNA-肽复合物的形成率提高至40%。另一方面，Kurz等改用带补骨脂素的DNA连接子，通过光交联反应与mRNA3'端杂交，将mRNA-肽融合体的形成率提高至40%。但该方法和夹板法都含有杂交的DNA 双链序列，会影响mRNA 3'端的稳定性。2003年，Miyamoto-Sato等使用Fluor-PEG Puro(p(dCp)2-T(Fluor)p-PEGp-(dCp)2-puromycin)连接子通过单链酶连接法得到了更加稳定高效的嘌呤霉素-mRNA模板，mRNA-肽复合物形成率可高达70%，并引入荧光素替代放射性标记。2006年，Hiroaki Suga在Microtechnologies in Medicine and Biology国际会议上发表关于Flexizyme的研究成果，使mRNA展示技术在大环化合物类药物高通量筛选开发中的地位受到重视。2009年，Tabata等将mRNA展示技术与微流控系统结合用于单链抗体片段(scFv)的体外筛选和进化，每轮体外的富集率高达106~108，仅经1~2轮体外筛选就从~1012天然随机scFv文库中获得了高亲和力的特异性抗体。2011年，Szostak等将mRNA展示技术应用于从体外翻译的蛋白质文库中酶的筛选和进化。2012年，Szostak等将mRNA展示技术应用于大部分为非天然氨基酸的大环肽的进化，体外筛选出用作凝血酶紧密结合抑制剂的大环肽。2018年，Emil等人开发了一种可实现高通量筛选碳氢化合订书肽的mRNA展示技术，通过该技术获得的肽均含有α-甲基半胱氨酸，并通过二溴二甲苯环化。
图5.mRNA展示技术的发展里程碑 mRNA展示技术属于体外展示技术，与包括噬菌体展示技术在内的体内展示技术相比，具有多种优势，主要体现在文库多样性和性质、筛选过程和实验周期方面。噬菌体展示技术等体内展示技术在构建库和筛选的过程中，需要依靠活细胞进行转化和扩增，因此，文库容量会受到细胞转染效率的影响，如噬菌体展示技术受限于大肠杆菌的转化效率，其构建的肽库容量通常小于1010。而mRNA展示技术的表达和筛选均在体外进行，无需依靠细胞，因此，去除了转化和克隆步骤，因此其文库多样性更高，库容高达1012-1014。表1.各类展示技术创建的文库容量对比 
不仅如此，体内展示技术还面临其它限制，包括：筛选环境必须与细胞生长环境相似、需考虑表达的毒蛋白对宿主的影响、融合蛋白活性的下降及动力学范围的缩小等。而各种体外展示技术不会受展示系统结构的影响，且可通过与体外翻译体系(如PURE系统)结合，解决了体内展示系统存在的这些问题。筛选过程较为简单。而相较于体内筛选，体外筛选更容易引入随机突变。mRNA展示技术可通过反复的随机突变和筛选, 使蛋白质进化，提高文库多样性。目前，随机诱变广泛用于定向进化中的突变，以分离具有所需功能的序列。mRNA展示技术在每一轮筛选中都使用PCR来扩增cDNA，由此产生的PCR产物可直接用于进行体外转录和翻译，与基于PCR的诱变和重组技术高度兼容。在许多方法中，表达蛋白质所在的密码子序列上下文可深刻影响生成文库的性质，如噬菌体展示依赖于细菌中的翻译机制进行蛋白质表达，酵母双杂交仅限于酵母细胞，也可以使用哺乳动物细胞，但效率较低。很多时候，由于折叠、运输、膜插入和复合问题，对某些蛋白质和支架的体内筛选偏差会增加。同时，部分未折叠的蛋白质通常会在细胞内迅速降解。这些问题可能导致功能分子的丢失或限制筛选文库的性质，而mRNA 展示技术则不受这些因素的限制。在筛选过程中，mRNA展示技术面临的条件限制较少。如酵母双杂交展示技术，由于相互作用发生在细胞核中，其反应条件不容易控制；核糖体展示技术需要在极温和的反应条件下进行。相比之下，mRNA展示技术的筛选过程可在更严苛的条件下进行，包括无天然氨基酸、非寻常的pH值和温度条件、非生理环境等, 只要表型和基因型间的连接足够牢固，就不易受到其它条件的干扰。亲和力筛选结束后，筛选产生的DNA模板经PCR扩增后即可进入下一个展示循环，从而极大地缩短实验周期。目前，研究人员通过体外展示方法筛选的高亲和力、特异性靶结合分子的成功例子包括肽、抗体、酶和工程支架，如纤连蛋白 III 型结构域和合成锚蛋白，这两者均可以模拟抗体功能。作为体外展示方法的一种，mRNA展示技术主要应用于发现RNA、小分子、蛋白质等新的蛋白质配体，阐明蛋白质与药物在细胞中的相互作用机制等。具体而言，可用于筛选高亲和力的反应物、抗体单链结构域的模拟肽、各种抗体重链结构域及与ATP、RNA、链亲和素及蛋白质等特异结合的多肽。此外, mRNA展示技术的其它特殊应用还包括: 自我组装蛋白质芯片和用非天然氨基酸和化学修饰多肽构建文库。然而，尽管mRNA展示技术由于其突出的优势拥有广泛的应用场景，该技术仍存在一些难点/劣势。首先，由于mRNA-蛋白质复合物的形成率和稳定性是影响mRNA展示效率的关键因素，因此，对mRNA展示技术的改进主要围绕连接子的改造展开，而作为技术关键的连接子需进行复杂的化学反应合成。其次，mRNA展示技术是不依赖于细胞的体外技术，而在无细胞表达体系制备过程中，内质网等内膜系统结构会遭到严重破坏，蛋白质在翻译之后一般难以正常加工修饰，而蛋白分子能否正确折叠对无细胞展示效果具有决定性的影响。比如：二硫键的形成需要一个氧化性环境，而转录过程需要加入一定浓度的还原剂，从而抑制了翻译后二硫键桥的形成，但是二硫键桥却在维持大部分蛋白分子空间结构稳定性方面起着重要的作用。另外，mRNA展示技术的难点还包括：mRNA及mRNA-嘌呤霉素连接产物也需要进行纯化才能使用；从核糖体纯化mRNA-蛋白质复合物；DNA-mRNA在合物生成中可能出现拓扑异构难题；及在翻译过程中会产生不完整的合成产物等。如开展对上述问题的研究，就必须在实验室中建立相关的技术平台，这增加了推广该技术的难度。Phylos是首家致力于开发高通量蛋白质芯片的蛋白质组学公司，它通过自有的PROfusionTM平台创建了高达100万亿个蛋白质的文库，用于分离合适的捕获蛋白。凭借PROfusionTM平台，Phylos发现了含有纤连蛋白III型结构域(FN3)作为分子支架构建的一类结合蛋白家族——Trinectins，其可作为简单/可靠的抗体替代品，用于创建目标结合蛋白。2003年，一家经历破产重组后的生物制药公司——Adnexus通过收购Phylos并获得了PROfusionTM技术，并将Trinectins更名为Adnectins。在对该技术平台的不断推进和发展过程中，Adnexus开发了第一款Adnectin类候选药物——Pegdinetanib(计划商品名为Angiocept™)，这是一款血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)拮抗剂，含94个氨基酸，可用作抗血管生成药物以治疗肿瘤。PROfusion™技术平台和Adnectins蛋白家族的可观潜力引来了医药巨头BMS的青睐。BMS于2007年初抛出了橄榄枝，与Adnexus合作开发和商业化创新肿瘤药物，在此次合作中，Adnexus 在多达6个研究项目中应用了PROfusion™技术，以筛选出Adnectins先导化合物提供给BMS，而BMS负责全球的开发和商业化活动。随着合作的深入，2007-09，BMS以$430Mn收购了Adnexus，将PROfusion™和Pegdinetanib一并纳入麾下，拓宽了BMS生物制剂管线和产品组合，也成为其向生物制药模式战略转型的重要一步。Pegdinetanib更名为BMS-844203，于2007-10进入治疗胶质母细胞瘤的Ⅱ期临床，并于2009-06进入治疗非小细胞肺癌的Ⅱ期临床。根据ClinicalTrials，其治疗非小细胞肺癌的Ⅱ期临床已终止，计划于2013-11在日本启动的治疗肿瘤的Ⅰ期临床申请也已撤回。经小编调查发现，该候选药物已无任何最新相关进展，关于BMS和PROfusion™的相关报道也近乎于无。Pegdinetanib和PROfusion™的相关研究为何突然“销声匿迹”，原因尚不可知。就目前已掌握的少量信息，并基于前述中提到的各种技术难点，小编大胆猜测，或许在mRNA展示技术的应用过程中，研究人员们遇到了尚无法解决的技术性难题，从而导致研究中断。
图6.Pegdinetanib的分子结构 Ra Pharma成立于2008年，总部位于美国，聚焦于补体生物学领域，专注于开发靶向补体级联反应中关键组分的多肽和小分子疗法，旨在为罕见病患者提供创新疗法。Ra Pharma的联合创始人是mRNA展示技术的发明人Szostak教授，其核心技术是基于Szostak教授实验室开发的大环多肽mRNA展示技术Extreme Diversity™平台。通过该平台可获得高度特异性和稳定的肽分子、极大提高了生物利用度、改善了细胞渗透性，解决了蛋白质-蛋白质相互作用及其他阻碍成药的问题。
图7.ExtremeDiversity™肽库筛选平台 基于Extreme Diversity™，Ra Pharma开发了新型大环肽类C5补体抑制剂Zilucoplan，它是一个含有十五个氨基酸的环状多肽，能以亚纳摩尔亲和力结合补体C5，通过共价抑制C5蛋白分裂成C5a蛋白和 C5b蛋白而发挥作用。此前，Zilucoplan已获得FDA授予的孤儿药资格，用于治疗全身性重症肌无力(gMG)。
图8.Zilucoplan作用机制 正是由于Ra Pharma在补体抑制剂领域的新型技术和潜在优势，2019-10，公司以$2.1Bn被UCB收购，后者由此进入补体药物领域。根据协议，双方将继续推进Zilucoplan在治疗gMG等罕见疾病的开发。PeptiDream成立于2006年，是一家源自东京大学的生物创新药公司，致力于约束肽/活性大环分子的快速筛选发现。公司的核心技术为PDPS技术平台，后者能高效率生产高度多样化(万亿级)的非标准多肽库，以鉴定高效和选择性强的靶向肽分子，从而开发基于多肽、小分子或PDC的疗法。
图9. PeptiDream主要的药物开发方向 Flexizyme及PDTS：Flexizyme是一种体外进化的核酶，由共同创始人Suga发现。Flexizyme能高效地使几乎任何天然/非天然氨基酸的所有tRNA带电，正是这创造性的发现使mRNA展示技术在大环化合物类药物高通量筛选开发中的地位更显举足轻重。Suga实验室应用flexizyme来生成氨基酸活化的tRNA，并应用于体外翻译系统——FIT系统。在FIT系统中，研究人员先使用flexizyme对要引入的衍生型非天然氨基酸与相应tRNA进行连接，并将其作为氨基酸元件加入到PURE系统中，经翻译后引入生成的多肽链，从而获得非天然多肽(如自发成环的多肽等)(图9 a)。基于此，Suga实验室构建了名为RaPID的技术平台，可快速构建并筛选库容量超过1012的非天然环肽化合物库(图9 b)。PDPS便是RaPID改进后的技术平台。PDTS(肽发现翻译系统)是一种无细胞的完全重组的体外转录翻译系统，它本身只能制备由20种天然氨基酸组成的肽库，但与Flexizyme技术结合使用时，可以构建由400多种不同氨基酸组成的肽库。
图10.FIT系统引入非天然氨基酸流程(a)及RaPID平台的筛选流程(b) 肽的环化技术：PDPS能构建各种约束/或环化肽库。与线性肽相比，约束肽具有许多显着优势，包括更高的亲和力、更强的选择性和卓越的体内稳定性。除环化技术外，PDPS 还结合了多种修饰技术，有助于快速筛选候选肽，显着加快了药物发现过程。PD技术：利用该技术可快速生成高度多样化的肽文库，这些肽文库可针对任何生物目标(包括特定蛋白、抗体等)进行筛选并识别候选肽分子。与传统方法相比，该技术十分简化且效率非常高。公司的业务主要由合作开发、许可授权、战略合作/自主开发共3大板块构成。公司在专注于核心技术的创新与改进的同时，还在广泛合作中扩大自己的影响力并获取收益。目前，公司已与多家大型制药企业建立研发合作关系，其中Novartis、Lilly、Genentech、Merck等公司不仅与其签订了合作开发协议，还直接引进了核心的PDPS筛选技术。截至2021-06-30，公司共有120个在研项目：82个肽/小分子候选药物和40个PDC候选药物。在研项目多数处于靶点验证→苗头化合物和苗头化合物→先导化合物阶段。其中，有40项处于靶点验证→苗头化合物阶段；55项处于苗头化合物→先导化合物阶段；16项先导化合物→GLP毒理试验阶段；9项GLP毒理试验→临床申请阶段。目前进入Ⅰ期临床的有2项，暂无进入Ⅱ期和Ⅲ期临床的候选药物。
图11.PeptiDream Pipeline 2017年夏天，曾在Phylos任职6年的Dr. 陈彦在美国创办了Elpis Biopharmaceuticals，这是一家致力于开发多功能免疫疗法的生物制药公司，旨在通过激活免疫系统来克服肿瘤耐药性。Elpis建立了自有的mRNA展示技术平台：mRNADisTM和mSCAFoldTM。2020-10-29，Elpis完成$30Mn的A轮融资，与种子轮融资合计共筹得资金$40Mn。mRNADisTM是容量为1013的全人类抗体文库，利用可溶性蛋白/活细胞进行筛选，这有利于生成与疾病相关表位和与具有挑战性的靶点(如多跨膜蛋白)特异性结合的抗体，因而能快速发现针对治疗靶点的高特异性、强效的ScFv和VH域抗体模块。同时，由于该文库的抗体为全人源，有助于开发稳定性高、免疫原性较低的可溶性抗体。mSCAFoldTM是Elpis基于对感兴趣的靶点及其相互作用要素间结构-功能关系的理解定制的库，可进行表位定向筛选。研究人员利用该平台筛选和鉴定具有重定向药理学特性(如激动剂、拮抗剂)的工程突变体，用于药品开发。
图12.Elpis技术平台 目前，公司的在研药物主要分为两类：实体瘤靶向免疫调节剂和用于血液系统恶性肿瘤的细胞疗法，分别有4款候选药物。肿瘤靶向免疫调节剂方面，EPIM-001为进展最快的候选药物，处于临床前阶段，计划于2022Q1提交IND申请；EPB-002为双特异性调节剂，主要靶向胰腺和膀胱的实体瘤。细胞疗法方面，EPC-001是进展最快的候选药物，为靶向CD22/CD19的调节剂，用于治疗R/R性B细胞恶性肿瘤，计划于今年启动由研究者发起的临床研究。
图13.Elpis Pipeline mRNA展示技术解决了噬菌体展示、酵母表面展示等体内展示技术面临的多数困难，为构建更多样化的文库提供了可能，有助于蛋白质体外筛选技术的进一步发展。然而，mRNA展示技术也有其自身的局限性，目前仍主要停留在实验阶段。未来该技术又将何去何从？是惊艳四方还是黯然退场？结局仍未可知……[1] 生物制药小编. mRNA展示技术. [2] 抗体密码. 无细胞展示技术——核糖体/mRNA/cDNA. [3] 张万巧等. mRNA展示技术. [4] 邹媛等. 分子文库展示技术. [5] 阎松等. 体外展示技术. [6] 卢明锋. 体外展示技术研究进展. [7] mRNA display: from basic principles to macrocycledrug discovery [8] In-vitro protein evolution by ribosomedisplay and mRNA display. [9] RNA-peptide fusions for the in vitroselection of peptides and proteins. [10] In Vitro Selection of Highly ModifiedCyclic Peptides That Act as Tight Binding Inhibitors. [11] Advantages of mRNA display selectionsover other selection techniques for investigation of protein–proteininteractions. [12] PeptiDream Website. [13] Ra Pharmaceuticals Website. [14] Elpis Biopharmaceuticals Website. [15] ClinicalTrial Website. [16] Wikipedia. [17] genomeweb. Phylos Raises $25.1 Millionfor Protein Chip Effort. [18] Clinical Leader Website. From MedicalResearcher To CEO.
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