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荧光补偿是指修正荧光光学信号在探测器之间相互渗漏并被数字化检测的过程。自单激光双色分析出现后，此过程变得十分重要。每种荧光素分子都具有自身的光谱发射范围。这些发射光谱之间存在相互叠加，在某些情况下此现象十分明显。 举例来说，如下图为FITC与PE荧光发射光谱的叠加情况。在一个双探测器系统中，可设计将FITC荧光从PE荧光中分离出来。检测荧光发射光时根据其波长和分布将选择其中一小部分进入探测器，这部分荧光可由不同的滤光片从全部发射光中选择特定波长范围的荧光来获得。这样FITC荧光由530nm的滤光片选择后送入探测器中；PE荧光则是由575nm滤光片来选择。但是有部分FITC荧光会出现在PE探测器中，这是因为它的发射光涵盖两个探测器滤片的过滤范围。这部分信号我们称之为荧光渗漏，因为它是由FITC荧光渗漏到PE探测器中的。 注意想要设计一组荧光滤片来只收集FITC或PE信号是不可能的；因为当同时使用这两种荧光染料时荧光叠加总是存在的。这样只要FITC荧光存在，就会在530nm区得到一个信号，同时也会在575nm区得另一些信号。如这时有PE荧光存在，它也将在575nm区收集。那我们如何才能计数多少信号是来自PE而又有多少信号是由FITC引起的呢？这个计算过程我们称为“荧光补偿”，如去除FITC在PE发射光谱带上的荧光来修正PE探测器中的信号。 一步法荧光补偿 如果一种荧光染料的发射光可以被两个含有不同波段的滤光片的探测器检测到，那么就能根据其中一个探测器的信号计算出另一个探测器中有多少信号。这是因为这两个信号是成比例变化的（如下图）。这个恒定特性是指我们能够根据绿色荧光探测器中曲线面积来精确推算出橙色荧光探测器的曲线面积。 这两个值的比值可在没有FITC以外荧光的情况下计算得知。用于此目的的样本被称为“荧光补偿调节样本”或是“荧光补偿质控物”，用于精确测定补偿值。对于典型的流式细胞仪来说，FITC发射光在橙色探测器中的信号大概是绿色探测器的15%。因此，如果我们从橙色探测器中减去绿色探测器信号的15%，那无论有多少FITC信号存在，经校准后的橙色荧光探测器信号将总为零。这时可在系统中加入PE荧光，橙色荧光探测器扣除了15%的绿色信号后将显示真正的PE荧光信号，而不用再考虑是否存在FITC荧光了。这就是“一步法”荧光补偿；在第二探测器中修正来自另一荧光的信号。 二步法（双）荧光补偿 从下图的荧光谱中可见PE荧光也有部分渗漏至FITC探测器中。通过检测只有PE荧光的细胞来获知此比例，一般它的数值是2%左右。这称之为PE荧光补偿校正物。 但如果PE荧光出现在FITC探测器中，而同时我们又使用FITC荧光来修正PE探测器中的荧光信号，那这还能有可能来正确修正荧光渗漏从而得到真正的荧光信号吗？试剂上，根据一些数学运算是有可能使用这种方法来精确调节补偿的。
现在流式细胞仪都是自动调节荧光补偿，不过也要做好准备工作。如当我们同时检测四种荧光素FITC、PE、Per CP、APC，做补偿调节，需要以下的样本，无任何染色的样本，FITC， PE， Per CP以及APC单染阳性的样本，这里需要一共5个管子。 在纯手工的年代，你需要画出这四个颜色两两配对的散点图，比如FITC-PE， FITC-Per CP， FITC-APC， PE-Per CP，PE-APC， Per CP-APC，一共6个散点图。 然后，先上未染色的样本，调节各个荧光通道的电压，使细胞都位于各个散点图的左下角。 在记录前，把每个样本都先跑一边，目的是观察电压的设置是否正确。比如FITC和PE会有重叠，上FITC阳性管的时候，虽然其他通道会有些信号，但FITC通道的信号应该最强。如果发生了其他通道信号强于目的通道的情况，就要进一步调节电压，使目的通道的信号最强。这样把每一个单染的样本都过一遍，确保目的通道的信号最强。 现在的仪器软件，不需要你自己画这些散点图，但是调节电压的这一步是必须的，可以在阴性对照管的页面下完成。 电压调节好以后，记录阴性对照和阳性单染样本的信号，然后机器会自动计算补偿值。 如果你要手工计算，这里是原则： 以FITC-PE为例。在散点图上，划分为四个象限。如果纵坐标是FITC， 横坐标是PE。调节电压后，阴性的细胞位于左下象限。这时可以得出阴性细胞横坐标（PE）和纵坐标（FITC）的平均荧光强度值。电压调好以后，上单色阳性样本。比如上牌FITC阳性，这时不要再改变电压了，而是调节补偿系数，最终目的就是让FITC阳性的细胞都位于向下象限，并且该细胞团的纵坐标（PE）荧光强度和阴性细胞团的值一致。其他颜色的两两补偿以此类推。 |
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