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NK细胞是先天免疫系统和对病毒的先天反应的核心淋巴细胞亚群。在外周血中，约10%的单核细胞是NK细胞，因此很容易从外周血单核细胞 (PBMC) 的密度梯度制剂中分离出来。NK细胞本质上对外来主要组织相容性(MHC)分子无反应。这使它们成为产生治疗性细胞产品的有吸引力的替代品，因为它们对MHC提供的抗原不敏感，因此它们可以用于同种异体环境，移植物抗宿主病(GvHD)的风险最小。尽管NK细胞携带MHC分子的激活和抑制受体，但移植物和宿主之间的MHC错配通常不足以导致病理变化。然而，最近的研究表明，宿主特定的因素可能对优化其潜力很重要。此外，通过增强的趋化因子受体增加对肿瘤生长部位（如骨髓）或肿瘤本身的归巢的改进已显示出前景 。 带有CAR受体的NK细胞 (CAR-NK) 现在被认为是一种有效的抗癌工具。最初，CAR-NK细胞的创建是使用为CAR-T细胞开发的结构进行的；然而，最近的发展已经纳入了对NK细胞的适应。然而，NK细胞带来了特殊和独特的问题。 与T细胞和B细胞不同，NK细胞通常不会克隆扩增，这使得CAR-NK细胞的生成、维持和扩增具有挑战性。NK-CAR细胞生成中最重要的阶段是将遗传元件引入NK细胞本身以及随后的CAR-NK细胞扩增。 自然杀伤细胞的来源外周血来源的NK细胞可以很容易地从外周血中分离出来，但很难设计。这背后的原因尚不清楚，但包括转导效率低和扩增不良。 为了避免这个瓶颈，NK 细胞已经从诱导多能干细胞 (iPSC)中产生，它可以产生更多的细胞并且更容易进行工程化。 NK细胞也可以从脐带血中产生。正如最近首次发表的CAR-NK细胞临床试验所证明的那样，来自该来源的NK细胞由于其更高的增殖能力而更容易进行工程改造。尽管取得了这一成功，但一个可能的缺点是脐带血来源的NK细胞相对不成熟。 一些试验使用了NK细胞系，特别是细胞系NK-92。细胞系相对容易设计，但出于安全考虑和必须在给药前进行致命辐射，因此它们不能在宿主中持续存在，因此不能提供长期保护，因此它们是不可取的。最近，饲养细胞系已普遍用于体外扩增NK细胞。这些MHC阴性细胞系，尤其是K562，通常被设计为表达膜结合细胞因子（IL-15 和 IL-21），并在使用前进行辐照 。 非病毒 CAR-自然杀伤细胞工程 与通过病毒载体的基因表达相比，基于非病毒的方法的 CAR表达通常是短暂的，存在几天。尽管如果序列可以整合，则可以实现长期表达，就像基于转座子的系统一样 。通常，核酸导入是通过电穿孔实现的，这是一种简单且经济高效的方法，因此适用于大规模临床应用。一个主要的缺点是电脉冲对细胞膜的透化很容易通过内部或外部细胞成分的不受调节的交换或产生永久性膜泄漏而导致高细胞死亡率。 自然杀伤细胞的mRNA转染 最初在2010年通过使用抗CD19转基因在未刺激和扩增的 NK细胞中进行转染研究了通过mRNA电穿孔产生的初级CAR-NK。CAR的表达范围从33%到81%。 已经确定，对于临床产品，电穿孔后CAR的表达取决于mRNA的剂量（25-200 µg/ml），并且应用的核酸越多，CAR的表达就会增加。有趣的是，转染后一天后扩增细胞的存活率(54%)低于未扩增细胞 (64%) 。然而，即使使用IL-2刺激，其他组也无法以高于10%的转染率转染外周血或脐带血来源的NK细胞。相比之下，NK-92细胞系的mRNA编码抗CD19CAR的转染效率导致更高的产量(47.2±8%)。 最近的协议已经实现了至少72小时持续时间的有效表达。最近已经表明，使用mRNA电穿孔可以共表达两种转基因，一种是 CAR，另一种是趋化因子受体。这产生了90%修饰细胞的转染率。通常，使用240-500V的电压在2-mm比色皿中电穿孔 5 µg加帽的聚腺苷酸化mRNA 4-5毫秒 。 最近公布的符合现行良好生产规范(cGMP) 的大规模NK 细胞扩增方案有助于将mRNA转染转移到临床中。MaxCyte或CliniMacs等符合cGMP的大规模电穿孔系统现在可用于生成治疗产品。 最近报道了使用化学方法（电荷改变可释放转运蛋白，或 CART）将CAR mRNA引入静息NK细胞。与使用4D nucleofector设备的电穿孔相比，这种方法结合了更高的效率，并且造成的损伤和表型变化更少。最后，衍生的CAR-NK 细胞对CD19+靶细胞具有细胞毒性。 总之，mRNA转染效率很高，但也有明显的缺点。复杂的多基因构建体的转染通常需要对单独的mRNA进行共转染，部分原因是难以生成长mRNA序列。此外，尽管mRNA具有效率，但它本质上是不稳定的，非整合性和非复制性，导致表达时间非常短。 自然杀伤细胞的DNA转染 最初，据报道，对细胞系NK-92(18)进行DNA电穿孔是成功的，但对于新鲜分离或扩增的人类NK细胞则没有报道。然而，在最近发表的一项协议中，作者能够通过事先优化质粒 DNA 浓度、靶细胞数、质粒大小、缓冲条件、电压以及脉冲数和宽度来转染IL-2扩增的原代NK细胞 .每个优化步骤都有助于提高转染效率，没有单一元素占主导地位。 相比之下，对于静息NK细胞，细胞数量至关重要，2-6×107个细胞/ml 是最佳范围。使用新方案将第一代和第二代CAR转染到IL-2扩增的NK细胞后，观察到40%的转染细胞，细胞活力高达约60%。这表示效率比标准协议提高了5倍。 与mRNA电穿孔相比，DNA电穿孔后细胞的活力较低，这可能是由于DNA到达NK细胞核所需的更苛刻的转染条件(18)或由于先天免疫系统的激活。转染的DNA比mRNA更持久，表达持续时间长达15天。 总而言之，DNA转染效率较低，但是可以轻松引入复杂的构建体，并且像mRNA非整合DNA是自限性的，因此与病毒方法相比具有良好的安全性。 自然杀伤细胞的病毒转导 转导是指通过病毒载体引入遗传物质，包括逆转录病毒和基于慢病毒的载体。在逆转录病毒的生命周期中，病毒 RNA被逆转录成双链cDNA，然后半随机整合到受感染细胞的基因组中。由于这些原因，这种策略通常需要更长的时间才能表达基因。基于这些病原体的载体有几个优点，可以相对简单地创建复杂的载体并随后可靠地将它们引入细胞。通常，这些载体的大小可以高达10kb，而不会在生产过程中导致效价的显着损失，从而允许插入高达7–8kbp的片段。此外，随着这些载体的整合，这允许在没有抗生素抗性标记的情况下对细胞进行永久性修饰。然后可以在宿主中长时间维持修饰的细胞。 为了提高病毒载体的安全性，已经创建了表达系统，其中包膜蛋白在单独的质粒上表达。这允许在称为假型化的过程中安全生成具有外源包膜蛋白的修饰病毒颗粒。 增强 NK 细胞转导的一种方法是选择最佳假型包膜蛋白。常用的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白G通常非常有效，因为它与存在于多种细胞中的LDL受体结合 。然而，它对淋巴细胞的感染效率低下，需要高病毒滴度，而这反过来往往对细胞有毒。然而，从嗜淋巴病毒（如麻疹或狒狒逆转录病毒）中选择包膜蛋白已被证明可以改善转导和整合。成功的转导还取决于病毒扩散到细胞表面和吸附到目标中。有包膜的病毒颗粒通常带有负电荷，因为它们来自细胞膜。这导致病毒体和细胞的排斥，干扰转导。阳离子聚合物如溴化己二甲胺（聚凝胺）或硫酸鱼精蛋白用于中和病毒粒子的负电荷，从而提高吸附效率和膜融合 。 另一种策略是通过使用交联剂如Retronectin或 Vectofusin-1来增强细胞和病毒的共定位。据报道，它们的性能优于它们的阳离子聚合物对应物。Retronectin 是一种源自纤连蛋白的嵌合肽，可促进病毒颗粒与细胞表面对应物之间的相互作用和共定位。同样，Vectofusin-1 促进病毒与细胞质膜的粘附和融合，尽管具体机制尚不清楚。对于哪种增强子显示出更好的转导优化，目前还没有达成共识。 逆转录病毒载体 由相关的alpharetroviral和gammaretroviral病毒产生的载体已被用于转导初级淋巴细胞，包括NK细胞。逆转录病毒转导的一个重要限制是逆转录病毒cDNA只能在核膜溶解时在有丝分裂期间整合到NK细胞基因组中。这种要求在非复制原代细胞中尤其成问题，但对于活化的NK细胞系则较少 (38)。 慢病毒载体 慢病毒载体被认为在遗传上更复杂，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体可以将其遗传信息整合到非分裂细胞中 。最近的数据表明，慢病毒载体在生成CAR-NK细胞方面的性能取决于它们表达的包膜蛋白。对于常用的VSV-G包膜蛋白，与逆转录病毒载体相比，慢病毒载体发现使用 VSV-G 假型颗粒的原代NK细胞的最高转导效率 。哪种包膜蛋白具有最佳性能尚不清楚，因为用 VSV-G 或猫内源性逆转录病毒包膜蛋白RD114-TR假型化的慢病毒载体的转导效率与原代人类NK细胞相似。另一组发现，与RD114-TR假型慢病毒载体相比，慢病毒/VSV-G载体产生的CD19-CAR表达细胞更少 。此外，狒狒包膜假型慢病毒载体BaEV-LV明显优于RD-114-TR和VSV-G假型慢病毒载体。VSG-V与低密度脂质受体LDL-R结合，该受体在活化的NK细胞上表达不佳 。相比之下，RD114与钠依赖性中性氨基酸转运蛋白ASCT-1和 ASCT-2结合，BaEV包膜蛋白也是如此。ASCT-1转运蛋白在 NK 细胞上强烈表达，并且在用IL-2和IL-15激活NK细胞后，ASCT-2上调。与RD-114-TR相比，BaEV包膜蛋白也被证明与ASCT-1的糖基化形式结合。这可以解释其在转导中的更高效率。 据报道，慢病毒转导可以通过使用旋转感染进一步优化，这是一种应用低RPM离心的方法。使用CD19 CAR慢病毒转导的脐血衍生NK细胞的自旋感染转导率范围为19%至73%，而静态转导的范围为12%至30%。 在转导协议的优化方面，Müller等人比较了 alpharetroviral载体和慢病毒载体。使用基于 Vectofusin-1的转导，RD114-TR假型alpha逆转录病毒载体可以实现82.9%的NKs转导CD19 CAR(36)。Suerth等人对病毒载体的类似比较研究。当使用RD114-TR假型 alpharetroviral载体时，证实了转染效率的优越性。尽管使用Rectofusin进行转导，但两种转导增强剂都可靠地优化了转导效率。据认为，由于使用更简单，Vectofusin-1 可能有利于大规模扩张。由于使用RD114-TR alpharetroviral载体Kellner等人获得稳定的高转基因表达率。建立了符合GMP的转基因NK细胞生产方案。按照说明，转导程序产生了>90%的CAR转导细胞。为了达到这种效率，使用逆连蛋白转导增殖的NK细胞。然而，这种方法的一个可能的缺点是使用K-562细胞系在转导之前和之后扩展NK细胞。此外，使用相对简单的CAR进行转导。 总之，目前没有普遍适用的基因转移方法。 几种将基因引入NK细胞的新方法正在开发中。这些包括具有更高安全性的替代病毒载体，例如腺病毒相关病毒 (AAV) 载体。mRNA生成和电穿孔技术的进步也将带来改进的转染。结合这两种方法，例如使用转座子或结合基于CRISPR/Cas9的集成，将结合长期表达和电穿孔效率。转座子技术尤其提供集成，无需复杂、昂贵且具有潜在危险的病毒转导系统。该系统仍然存在的一个缺点是其相对低效。最后，初级NK扩增方案的改进也将带来基因工程的改进，因为更容易设计健康增殖细胞。载体本身也将针对NK微环境进行优化，例如通过使用 DAP12或NKG2D信号域。哪种构建体最适合NK细胞是当前研究的重点。 CAR-NK细胞在宿主体内的耐久性目前也是一个有争议的问题。CAR-T细胞可以在宿主体内存活数年，有明确的数据表明这有助于肿瘤清除。CAR-NK细胞是否属于这种情况尚不清楚。目前普遍认为同种异体NK细胞的半衰期相对较短，尽管最近有报道称CAR-NK细胞在体内持续存在至少1年 。原代NK细胞临床试验的长期随访将阐明CAR-NK细胞的持久性是否有助于治疗效果。 将基因引入 NK 细胞的最成功替代方法是通过电穿孔快速瞬时表达或通过病毒载体缓慢持续表达。因此，正确选择转染方案是设计和执行成功临床试验的重要因素。 |
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