|
稳定表达细胞株（稳转细胞株）指能持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达的细胞株。在基因功能的研究中，稳定表达细胞株弥补了瞬时感染（或转染）实验中外源基因表达时间短的缺陷，便于长期观察蛋白间相互作用以及基因对细胞功能的影响。构建稳定细胞株的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性（最常用的有新霉素（Neomycin）、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、嘌呤霉素（Puromycin）或G418）的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选混合阳性克隆（针对转染效率较高的细胞株）。有些细胞株转染效率比较低，混合阳性克隆蛋白表达降低或不均一不明显，这种情况还需在阳性混合克隆的基础上得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。 慢病毒感染稳定细胞株构建 慢病毒载体（Lentiviral vector，LVs）是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，可有效感染并进入目的细胞，对分裂期细胞及非分裂期细胞均具有较高的感染效率。它能高效的将目的基因（或shRNA）导入各种细胞系。慢病毒载体基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体。进入细胞核后，目的基因或转录shRNA的DNA随机整合到细胞基因组中，整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中表达目的蛋白或产生RNAi干扰。利用载体中所含的抗性标志进行筛选，可得到稳定表达或沉默特定基因的细胞株。  图1 利用慢病毒产生稳定细胞系的示意图（Neha Tandon. 2018） 稳转细胞株构建方法 （1）细胞检测（细胞状态是否良好、有无支原体污染等）。 （2）慢病毒包装及纯化：需要一个穿梭质粒（携带目的基因） 、一个或两个包装质粒（编码病毒的核心蛋白、复制所需的酶和基因表达调节因子等）以及一个包膜质粒（编码蛋白质外壳）。配制转染体系，将质粒转染至293T细胞中，并采用超滤浓缩或超速离心沉淀病毒液。 （3）病毒转导与药筛：提前摸索细胞的最佳MOI值，并对铺板细胞进行病毒液感染，如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达。在转染3-4天后开始对细胞进行加药筛选。 注：为了达到最佳的实验效果，建议在正式实验前进行3-4种不同MOI值感染预实验；对于同种细胞不同种抗生素或是不同细胞对同种抗生素的使用，也建议提前摸索最佳使用浓度。  图2 我司慢病毒感染细胞效率实例 （4）稳转细胞株的检测：mRNA水平检测（我司采用qRT-PCR法）。检测合格后，对细胞系进行扩大培养与冻存保种。 以上步骤为构建多克隆稳转细胞系流程，若需构建单克隆稳转细胞株，则还需进行以下步骤： ① 对筛选后的多克隆稳转细胞株进行流式分选，即分选出单克隆细胞； ② 单细胞经过增殖后，继续进行第二轮筛选； ③ 筛选完成后，收集部分细胞进行mRNA水平检测，选择结果正确的单克隆细胞冻存保种。 （1）能将外源基因有效整合进宿主染色体中，外源基因表达水平高且稳定； （2）广泛的宿主，几乎可以感染所有类型的细胞（可感染分裂和不分裂的细胞），特别适合质粒载体转染效率低的细胞； （3）适用范围广，可用于体外细胞系和活体动物模型，研究基因和RNAi等； （4）转导效率高，目的基因整合到宿主细胞基因组的概率大大增加。 舒桐医疗科技有限公司拥有丰富的稳定细胞株构建经验。根据不同类型和转染效率的细胞以及需要表达的外源基因的大小，针对性地选择病毒感染或者转座子介导的质粒稳定转染的方法进行稳定表达细胞株构建。 关于舒桐 如需获得更多信息，请咨询我们： 电话： 400-6309596 15022705442（同微信） 企业官网： http://www. 产品订购/技术支持： service@ 参考文献： Neha Tandon,. et al. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018. 8(21): e3073. Tomás HA,. et al. LentiPro26: novel stable cell lines for constitutive lentiviral vector production. Scientific Reports. 2018. 8(1):5271. Ferreira MV,. et al. Progress and perspectivesin the development of lentiviral vector producer cells. BiotechnolJ. 2021. 16(1):2000017. |
|
|
