鸡血藤哪里的最好？不同产地来源鸡血藤的等级划分

鸡血藤哪里的最好？不同产地来源鸡血藤的等级划分
  风清扬        2020-04-29 14:48:23
摘要：目的基于“成分反映活性，活性指向功效”的中药质量控制研究思路，建立鸡血藤饮片等级评价模型。方法采用超高效液相色谱（UPLC）技术建立鸡血藤饮片的儿茶素、表儿茶素含量测定方法，以ABTS·+清除率、羟自由基清除率和DPPH·清除率作为体外抗氧化活性评价指标，运用Logistic的二分类算法，将儿茶素、表儿茶素含量指标和抗氧化活性指标进行关联分析，最终建立用于鸡血藤4个等级（优、良、中、差）评价研究的“主成分分析-二分类Logistic回归”模型。结果不同产地鸡血藤饮片的儿茶素和表儿茶素质量分数分别介于0.40～1.26 mg/g、0.57～2.02 mg/g；抗氧化指标ABTS·+、羟自由基和DPPH·清除率分别介于12.96%～51.76%、30.65%～66.65%、37.65%～60.33%。二分类Logistic回归分析结果显示，17个批次的鸡血藤及其2个伪品（大血藤和牛马藤）饮片分布在优级、中级、差级各有5个批次，良级有4个批次，拟合概率P值均大于94%。结论基于Logistic回归分析建立的的鸡血藤等级评价模型，可用于不同产地来源鸡血藤的等级划分。



鸡血藤Spatholobi Caulis为豆科密花豆属植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn.的干燥藤茎，具有活血补血、调经止痛、舒筋活络之功效，主产于广东、广西、云南等地区[1]，但由于野生品与栽培品不加区别、生长周期不同、采收时间不同、运输贮藏差异等因素导致药材质量参差不齐[2-4]。现代药理学表明，鸡血藤具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、调节血脂等药理活性[5-7]。氧化应激在病毒感染、肿瘤形成、动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病的发病机制中起着重要作用，抗氧化剂可以减缓氧化应激带来的危害。已经有多项研究表明鸡血藤提取物具有明确的抗氧化作用，有望成为一种替代或辅助治疗氧化应激性疾病的药物[8-9]。鸡血藤的抗氧化能力主要来自其黄酮类成分儿茶素和表儿茶素，二者单体富集产生的原青花素显示出较强的抗氧化活性[10]。但有数据显示不同来源的鸡血藤饮片中儿茶素与表儿茶素含量差异较大[11-12]。



《中国药典》2015年版规定鸡血藤的检查项目包括性状鉴定、显微鉴别、薄层色谱鉴别、水分检查、灰分检查以及醇溶性浸出物检查等[1]；目前对于鸡血藤的质量评价仅集中于测其一种或几种有效成分含量[13-14]，此法判断其质量优劣有失偏颇，难以预测中药复杂的化学实体与生命分子网络的交互作用。



由于中药成分组成的复杂性，以个别化学指标成分控制中药质量的模式还存在与临床有效性、安全性关联不紧密等问题，而生物活性测定是反映临床功效的基本方法之一。近年来，有学者提出在化学含量测定的基础上，开展中药复方的生物活性测定，可以综合评价并控制其质量[15-17]。因此本研究对不同批次的鸡血藤及其伪品的儿茶素和表儿茶素含量、体外抗氧化能力进行测定，再通过二分类Logistic回归分析[18-19]预测出鸡血藤饮片归属等级，以期为临床选择品质优良的原料药提供依据。



1仪器与材料



1.1仪器



FW-1000AD高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司；ACQUITY H-CLASS型超高效液相色谱系统，美国沃特世公司：包括二元超高压溶剂系统、FTN自动进样管理器、PDA检测器和Empower3色谱工作站；1510型全波长酶标仪，美国赛默飞公司；Sartorius CPA225D十万分之一分析天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅，上海科恒实业发展有限公司；Micro 17R美国赛默飞微量低温冷冻离心机，上海珂淮仪器有限公司。



1.2试剂



鸡血藤对照药材（批号S324-N1P9）购于中国食品药品检定研究院；对照品(+)-儿茶素（批号MUST-17060115）、表儿茶素（批号MUST-18050411），购于成都曼思特生物科技有限公司，HPLC测定质量分数分别为99.96%、99.98%；甲醇，分析纯，成都市科隆化学品有限公司；甲酸，美国Sigma-Aldrich化工有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，德国默克公司；屈臣氏水，屈臣氏集团（香港）有限公司；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法），上海碧云天生物技术有限公司；羟自由基（OH·）试剂盒（批号W27F10E81251），南京建成生物工程研究所；DPPH试剂，批号W27F10E81251，上海源叶生物科技有限公司。



1.3药材



本实验所使用的鸡血藤饮片经陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心刘世军副教授鉴定为豆科密花豆属植物密花豆Spatholobus suberectus Dunn.的干燥藤茎经加工后制成的饮片。19批鸡血藤饮片及伪品大血藤Sargentodoxa cuneata(Oliv.)Rehd.etWils.和牛马藤Mucuna sempervirens Hemsl.信息见表1。

  

2、鸡血藤哪里的最好？含量测定方法与结果



2.1含量测定



2.1.1鸡血藤粉末的制备称取不同批次的鸡血藤饮片，经FW-1000AD高速万能粉碎机粉碎成过4号筛（65目）的粉末，备用。



2.1.2供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇40 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，抽滤，用10 mL 70%乙醇洗涤残渣2次，90℃水浴蒸干，10 mL 70%乙醇定容，滤过，取续滤液，即得。



2.1.3混合对照品溶液的制备取儿茶素和表儿茶素对照品适量，精密称定，加甲醇溶剂制成含儿茶素0.29 mg/mL和表儿茶素0.35 mg/mL的混合对照品溶液，即得。



2.1.4色谱条件色谱柱为AcquityUPLC®BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0～3 min，5%乙腈；3～20 min，5%～15%乙腈；20～21 min，15%乙腈；21～23 min，15%～5%乙腈；后运行2 min；体积流量0.4mL/min；柱温为35℃；检测波长280 nm；进样量为5μL。理论塔板数以儿茶素、表儿茶素计算均大于4 000。



2.1.5系统适应性将不同产地供试品溶液和混合对照品溶液分别进样5μL，记录280 nm色谱图（图1）。通过比较在线紫外光谱图和保留时间，儿茶素和表儿茶素强度适中且与相邻峰分离较好（分离度＞1.5），因此选作参照物峰。



2.1.6线性关系考察分别吸取一定量的“2.1.3”项下制备的混合对照品溶液，加甲醇稀释成儿茶素质量浓度分别为29、58、87、116、145、174μg/mL，表儿茶素质量浓度分别为35、70、105、140、175、210μg/mL的系列溶液，按照“2.1.4”项下色谱条件进样。以峰面积积分值（A）对系列对照品溶液质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程分别为儿茶素A＝4 704.6 C－2 059，r＝0.999 8；表儿茶素A＝5 151.2 C－8 527.3，r＝0.999 4；结果表明儿茶素在29～174μg/mL，表儿茶素在35～210μg/mL与峰面积线性关系良好。



2.1.7精密度试验取同一供试样品（S1）约2 g，按“2.1.4”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，结果显示儿茶素、表儿茶素保留时间的RSD为0.94%、1.02%，峰面积的RSD分别为2.72%、0.91%，表明该方法精密度良好。



2.1.8重复性试验取同一批次鸡血藤样品（S1）约2 g，按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果显示儿茶素、表儿茶素保留时间的RSD分别为1.15%、1.13%，峰面积的RSD分别为1.86%、2.66%，表明方法重复性良好。



2.1.9稳定性试验取同一供试品溶液（S1）约2 g，分别于0、6、12、18、24 h，按“2.1.4”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，结果显示儿茶素、表儿茶素保留时间的RSD分别为0.42%、0.89%，峰面积的RSD分别为1.33%、2.165%，表明该方法稳定性良好。



2.1.10加样回收率试验取鸡血藤药材样品（S1）约1 g，平行6份，精密称定，加入相应的儿茶素、表儿茶素对照品，按供试品溶液的配制方法处理并测定，计算回收率，结果儿茶素、表儿茶素的平均加样回收率分别为99.09%、100.40%，RSD分别为1.80%、1.57%，结果表明本方法准确性良好。



2.1.11儿茶素和表儿茶素的含量测定不同批次鸡血藤及其伪品中儿茶素、表儿茶素的含量测定结果见表2。结果显示陕西步长制药有限公司提供的鸡血藤饮片中（S1）儿茶素的含量较高，广东韶关产地鸡血藤中（S15）的儿茶素含量较低，伪品大血藤（S18）中的儿茶素含量属19个批次中最低；安徽大别山鸡血藤（S11）中表儿茶素的含量较高，广西贺州（S12）鸡血藤中的表儿茶素较低，伪品大血藤（S18）和牛马藤（S19）中的表儿茶素处于较低水平。



2.2抗氧化活性测定



2.2.1鸡血藤提取液制备取不同批次的鸡血藤及其伪品粉末（过四号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得鸡血藤提取液。



2.2.2 ABTS·+自由基清除率的测定将各批次鸡血藤及其伪品按“2.2.1”项下方法制备提取液。按照总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS快速法）说明书操作，计算不同批次鸡血藤ABTS·+清除率。结果见表3，可得广西桂平大洋岭（二级红）（S4）的鸡血藤ABTS·+自由基清除率较高，安徽大别山（S11）的鸡血藤ABTS·+自由基清除率较低。+

  

  

2.2.3 OH·清除率的测定将各批次鸡血藤按“2.2.1”项下方法制备提取液。方法参考南京建成生物工程研究所提供的OH·试剂盒说明书，计算出样品的OH·清除率。结果见表3，可得广东普宁市优级鸡血藤（S6）清除OH·能力较强，大血藤（S18）清除OH·能力较弱。



2.2.4 DPPH·自由基清除率的测定用甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，避光保存备用，另配制2.0 mg/mL的维生素C溶液备用，实验采用微量法进行加样，室温下避光静置30 min，用酶标仪测定517 nm处的吸光度值。计算不同批次样品DPPH·自由基清除率，结果见表3，可得从广西购进的优级鸡血藤（S10）DPPH·自由基清除率较高，越南进口（S17）鸡血藤DPPH·自由基清除率较低，伪品大血藤（S18）DPPH·自由基清除率却相对较高。



2.3鸡血藤饮片等级分类



影响鸡血藤饮片质量的因素主要分为2类：第1类是生物活性，如体外抗氧化活性；第2类是主要成分的质控含量。由于模式识别模型的建立和参数的确定是由数据驱动，因此需要利用药材分类标准来生成数据作为建模基础。



2.3.1主成分分析（PCA）为了更直观地评价模型对样品的分类能力，对各样品数据进行降维处理，采用PCA方法观察样品差异情况。将提取的数据（n＝3）进行数据对齐、积分、标准化处理后，导入Simca-p 14.1软件，以影响因素（指纹图谱导出的各成分峰面积、抗氧化活性指标）作为观测值（X）进行PCA。由相关系数矩阵（R）得到特征值、方差贡献率（R2Y）和累积方差贡献率。模型自动拟合2个主成分，模型拟合度为94.4%（图2-A）。第1主成分PC1的贡献率为98.0%，包合差异信息最多，说明模型拟合能力较好。以前2个主成分建立投影，得到散点图（图2-B），进行初步的鸡血藤饮片分类。并对各批数据进行聚类分析（HCA），由图2-C可见，鸡血藤正品各等级间有明显的分类距离。陕西步长制药有限公司（S1）、陕西兴盛德药业有限责任公司（S2）、广西平乐县（良，S7）、广西平乐县（中上，S8）、广西（统，S9）、广西柳州（S13）、云南昆明（次，S14）鸡血藤被分为一类（黄色）；广西桂平大洋岭（特红，S3）、广西平乐县（优，S5）、广东普宁市（优，S6）、浙江磐安县（S16）、越南进口（S17）鸡血藤被归为一类（蓝色）；广西桂平大洋岭（二级红，S4）、广西（优，S10）、广西贺州（S12）、广东韶关（S15）鸡血藤被分为一类（绿色）；安徽大别山（S11）鸡血藤被归为一类（红色）。结果表明，采用PCA的分类分析具有较高的可靠性。



2.3.2 Logistic建模[18-19]根据“2.3.1”项的预测结果，对不同等级代表样本进行赋值，优（I）、良（II）、中（III）、差（IV）分别赋予响应值4、3、2、1。以SPSS20.0软件实现Logistic模型参数的求解，得到模型表达式分别为P优＝exp(187.963＋0.270 XABTS＋1.797 XOH―5.934 XDPPH＋145.579 C儿茶素―159.447 C表儿茶素)/[1＋exp(187.963＋0.270 XABTS＋1.797 XOH―5.934 XDPPH＋145.579 C儿茶素―159.447 C表儿茶素)]，P良＝exp(−106.767＋1.961 XABTS＋4.503 XOH―3.734 XDPPH―173.123 C儿茶素＋87.723 C表儿茶素)/[1＋exp(−106.767＋1.961 XABTS＋4.503 XOH―3.734 XDPPH―173.123 C儿茶素＋87.723 C表儿茶素)]，P中＝exp(−450.921＋12.810 XABTS―3.969 XOH＋0.408XDPPH―197.176 C儿茶素＋248.085C表儿茶素)/[1＋exp(−450.921＋12.810 XABTS―3.969 XOH＋0.408 XDPPH―197.176 C儿茶素＋248.085 C表儿茶素)]，P差＝exp(−204.710―2.192 XABTS―2.575 XOH＋6.070 XDPPH＋88.536 C儿茶素＋19.628 C表儿茶素)/[1＋exp(−204.710―2.192 XABTS―2.575 XOH＋6.070 XDPPH＋88.536 C儿茶素＋19.628 C表儿茶素)]。将各指标实测值代入各式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定鸡血藤饮片等级。Logistic回归模型对上述样本的拟合结果与实际结果完全一致，说明其可以很好地表达投料饮片等级分类标准，各等级判断如表4所示。

  

3讨论



3.1供试品制备工艺优化



鸡血藤的主要化学成分为儿茶素和表儿茶素，二者均易溶于水和醇，根据其溶解性，分别以水、乙醇、甲醇为溶剂进行提取实验[11-12，20-21]，测定儿茶素和表儿茶素含量，结果70%乙醇溶剂中主要化学成分的含量最高。又分别比较了冷浸、加热回流、超声振荡提取3种提取方法，在提取充分的条件下，加热回流、超声振荡提取2种方法得到的指纹图谱全貌及各峰强度均无明显差别，综合比较，超声振荡提取方法简便，不易破坏有效成分，是黄酮类成分分析常用方法，适合大量样品的快速提取，最终采用超声振荡提取法。为了获得最佳的参数设置，选择超声时间（30～80 min）、超声温度（30～60℃）、超声体积（20～60 mL）作为优化参数，以儿茶素和表儿茶素提取率作为评价指标。优化结果显示，超声时间为30 min，超声温度为30℃时，超声体积为40 mL提取率较高。



3.2色谱条件优化



采用UPLC技术测定不同批次鸡血藤含量时，曾选用甲醇-0.02%磷酸水溶液[21]、乙腈-0.1%甲酸水溶液[22]、甲醇-冰醋酸-水[12，20-21]为流动相，发现乙腈-0.1%甲酸水溶液流动相为最佳，鸡血藤中儿茶素、表儿茶素得到较好分离，且峰形良好。指纹图谱分析考察发现280 nm波长下样品中色谱峰信息丰富，背景噪音低。



按照本实验设置的洗脱程序，儿茶素和表儿茶素保留时间分别为2.38和5.64 min。为保证各批次样品充分洗脱，因此，将洗脱时间设置为25 min。



3.3指标测定及方法选择



现代药理学研究表明，鸡血藤提取物有很强的抗氧化活性[10，23-24]，其产生主要作用的是儿茶素和表儿茶素单体富集产生的原青花素。因此，可以将抗氧化能力作为本次饮片等级评价的指标之一。目前评价鸡血藤抗氧化能力的方法主要分为体内、体外2种[25-26]，相较于体内实验[27-29]，体外评价抗氧化能力主要通过测定鸡血藤提取液的ABTS·+自由清除率、羟自由基清除率和DPPH·自由基清除率来反映[24，30-31]，该法具有简便、迅速、影响因素少的特点，对于该实验鸡血藤批次较多，体外研究法是较为简便的方法。



3.4儿茶素与表儿茶素含量与抗氧化能力的关系



本研究显示儿茶素和表儿茶素含量与其体外抗氧化能力并不成正比，这说明鸡血藤饮片体外抗氧化能力是其多种成分共同作用的结果，进一步说明建立二分类Logistic算法评价鸡血藤饮片等级的合理性，也为鸡血藤饮片的质量控制提供一定的依据。





来源：赵梦利，刘妍如，宋忠兴，唐志书，段金廒，陈琳，刘峰，陈彦斌，许刚，史鑫波.基于成分-抗氧化活性相关的鸡血藤饮片等级评价研究[J].中草药，2020，51（4）:943-949.