|
发布日期：2016-04-20  赵立艳(1)， 陈贵堂（2） ，赵广华（3），胡小松（3） (1．南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095；2．中国药科大学食品质量与安全教研室， 江苏南京210009；3．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083) 摘要：将雨生红球藻藻粉经过乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂提取后，经过皂化，得到虾青素（超级维生素E）提取物，测定了提取物皂化前后的抑制油脂过氧化能力、清除DPPH·自由基能力和还原力，结果表明，雨生红球藻提取物皂化前后在三种评价方法中都表现出了较强的抗氧化活性。 关键词：雨生红球藻，虾青素，皂化，抗氧化活性 中图分类号：TS202．3 文献标识码：A 文章编号：1002-0306(2008)09-0081-04 虾青素（又名超级维生素E)不仅是色泽鲜艳的着色剂，更是功能强大的生物活性物质，很多研究表明，虾青素具有多种生理功能，如防治与氧化相关的疾病、预防癌症、预防与年龄相关的视黄斑退化和中枢神经疾病、增强免疫力等等。虾青素（超级维生素E）的这些生理功能与其具有抗氧化活性密切相关，其具有很强的清除单线态氧、清除自由基和防止脂质过氧化的能力。虾青素作为一种脂溶性抗氧化剂，类似于维生素E，在生物膜和富含脂质的组织中表现出优良的抗氧化性能，而且用小鼠肝线粒体和红细胞进行的体外抗氧化实验发现，虾青素的抗氧化效果优于维生素E。饮食中抗氧化剂长期以来倍受国内外学者关注，这是因为：食物中抗氧化剂能够保护食物免受氧化损伤而变质；在人体消化道内具有抗氧化作用，防止消化道发生氧化损伤；吸收后可在机体其他组织器官内发挥作用；来源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作为治疗药品。抗氧化剂在食品和生物体系中的抗氧化活性受很多因素的影响，其中主要包括：抗氧化剂在水相和油相间的分配效应、氧化条件和环境、被氧化底物的物理状态等。本文选用了三种不同的抗氧化评价方法，测定了皂化前后雨生红球藻中提取物的抗氧化活性，除了更加明确虾青素的抗氧化机理外，还比较了提取物皂化前后的抗氧化效果。 1 材料与方法 1．1 材料与仪器 雨生红球藻藻粉 荆州市天然虾青素有限公司；亚油酸 美国Fluke公司；2，2-二苯代苦味肼(DPPH ·) 美国Sigma公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇、正己烷、丙酮、二丁基羟基甲苯(BHT)、氢氧化钾、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫氰酸铵、氯化亚铁、三氯化铁、硫代巴比妥酸、盐酸、三氯乙酸 均为国产分析纯。 TDL-5-A 离心机 上海安亭科学仪器有限公司； AY120 型电子天平 日本岛津有限公司； HZQ-C 空气浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂；电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂； UV-190 紫外可见分光光度计 北京谱析通用仪器公司；SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 郑州市上街华科仪器厂；R-501 旋转蒸发器 上海中顺生物科技有限公司。 1．2 实验方法 1．2．1 样品制备 1．2．1．1 雨生红球藻粗色素油提取物(E)的制备 称取200mg冻干的雨生红球藻粉，加入体积比为2：l的乙醇和乙酸乙酯的混合溶剂，按以下条件提取：温度25℃ 、提取时间6h、溶剂量l2mL，提取2次。提取物经过离心(3000r／min，l5min)后，收集上清液，用真空旋转蒸发器将上清液浓缩，浓缩后转移至棕色瓶内，用氮气挥干残留的溶剂，密封后保存于-20℃备用。 1．2．1．2 粗色素油皂化物(S)的制备 将上述粗色素油提取物按以下条件进行皂化：粗色素油浓度4．5mg／mL、碱的浓度0．05mol／L、皂化温度30℃ ，皂化时间20min： 得到的皂化物经过大孔树脂除碱、硅胶分离，收集到的红色收集液用真空旋转蒸发器进行浓缩，浓缩后转移至棕色瓶内，用氮气挥干残留的溶剂，密封后保存于-20℃ 备用。 1．2．2 提取物抗油脂过氧化力的测定 1．2．2．1 硫氰酸铁法(FTC) 参考Osawa和Zainol的办法，并略加修改。取1mL亚油酸乙醇溶液(亚油酸2．5mL溶于l00mL无水乙醇中)，与2mL0．05mol／L pH7．0的磷酸盐缓冲液混合，超声波震荡30min，然后取2．0mL样品或BHT 置于25mL 试管中，使BHT(B)、E样品和 S 样品的终浓度为0．05、0．1、0．2mg／mL，分别记为B1、B2、B3、E1、E2、E3、S1、S2、S3，均匀混合后，于60℃震荡(每分钟约80次)，每隔24h取出样品0．1 mL，依次加入9．7mL 75％(V／V)乙醇溶液、0．1mL 30％ (W／V)硫氰酸铵溶液及0．1mL 氯化亚铁溶液(20mmol／L氯化亚铁溶于3．5％ (V／V)的盐酸中)，震荡均匀后，准确反应3min，检测500nm 下的吸光值，吸光值越低，表示样品的抗氧化能力越强。并以2．0mL的蒸馏水取代样品作为对照组。 1．2．2．2 硫代巴比妥酸反应物法(TBARS) 在上述FTC方法中，待对照吸光值达到最大后，隔ld取样，用于本方法的测定，具体操作如下：取样品1mL，加入2ml 20％ (W／V)三氯乙酸(TCA)溶液和2mL 0．67％ (W／V)硫代巴比妥酸(TBA)溶液，沸水浴15min，流水冷却后，3000r／min离心20min，以蒸馏水代替样品作为空白管调零，取上清液在532nm 处测定吸光值，按下式计算过氧化抑制率： 过氧化抑制率(％ )=(1 - 样品管吸光度／对照管吸光度) × 1O0％ 1．2．3 清除DPPH ·能力的测定 用乙醇将样品稀释，使样品终浓度分别为0．05、0．1、0．2、0．25、0．3mg／mL，取不同浓度的样品溶液3mL，加入2mL 0．1mmol／L 的DPPH ·乙醇溶液，充分混匀后，于黑暗处室温放置20min，然后测定517nm 下的吸光值，以 BHT 为参照，样品对DPPH ·的清除率按下式计算：清除率 = [1- (A1 - A2)／A0] × 100％ 式中A0 ：DPPH ·乙醇溶液的吸光值；A1：DPPH ·乙醇溶液加入样品溶液反应20min后的吸光值；A，：样品溶液的吸光值。 1．2．4 还原能力的测定 取1．5mL浓度分别为0．25、0．5、0．75、1．0、1．25mg／mL的样品或 BHT 甲醇溶液，加入1．5mL pH6．6的磷酸盐缓冲溶液(0．2mol／L)和1．5mL 1％ 的铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20min后迅速冷却，加入1．5mL 10％ 的三氯乙酸，混合后以3000r／min离心10min。取上清液2．5mL，加2．5mL蒸馏水和0．5mL 0．1％ 的三氯化铁，然后在700nm 处比色，以水为空白，吸光值越大，则样品的还原能力越强。 2 结果与讨论 2．1 抗油脂氧化能力 脂类包括的范围很广，是构成生物膜的主要成分，脂类中的不饱和脂肪酸(LH)会发生过氧化，脂类过氧化过程中会产生L·、LO ·、LOO ·等自由基以及LOOH，这些产物会损伤生物细胞。因此，抑制脂类过氧化具有重要的生物学意义。 硫氰酸铁盐(FTC)比色法是基于在酸性条件下，脂质氧化形成的过氧化物可将Fe2+氧化成Fe3+，然后Fe3+与硫氰酸根离子可形成在480～515nm 内有最大吸收的红色络合物。通常用500nm 处吸光值的高低表示物质抗脂质过氧化的能力，吸光值越小，表明物质的抗脂质过氧化能力越强。硫代巴比妥酸反应物(TBARS)值法是评价油脂的氧化程度的常用方法。油脂或亚油酸氧化后的终产物主要是丙二醛，这些过氧化产物与硫代巴比妥酸作用生成有色化合物，该有色化合物在530nm 左右有吸收。本实验测定的抗油脂氧化能力的结果如图1和图2所示。
由图中可以看出，BHT和皂化前后的样品都显著抑制了亚油酸的氧化，而且分析纯的 BHT 的效果要比我们所用的粗提物效果好的多，比较B、E、S样品的抗亚油酸氧化能力，我们可以看出，在相同浓度下，三种样品的抗亚油酸氧化能力大小依次为：B>E>S。皂化前的提取物(E)比皂化后的提取物(S)抗油酸氧化能力强，这可能与它们的疏水性有关系 。
另外，三种样品在本实验采用的两种测定抗亚油酸氧化的方法中都呈现出了剂量效应关系，也就是说，随着 BHT 和雨生红球藻提取物浓度的增加，它们的抗亚油酸氧化能力也是增强的。皂化前以虾青素酯为主的提取物以及皂化后以游离虾青素为主的提取物在浓度为0．05mg／mL时过氧化抑制率就达到了60％ 以上，当浓度为0．2mg／mL时，过氧化抑制率则分别达到了84．07％和81．54％ 。 2．2 清除DPPH·自由基能力 DPPH ·是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm 处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH ·的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化，来评价样品对DPPH ·自由基的清除效果。BHT以及皂化前后的雨生红球藻提取物对DPPH ·的清除效果如图3所示。
由图3可以看出，在相同浓度时，三种样品的清除DPPH · 自由基的能力依次为：B >E>S。BHT 浓度为0．05mg／mL时清除率就达到了52．59％ ，随着浓度的增加，BHT 对 DPPH ·的清除率也增加；但在本实验的条件下，当浓度增加到0．2mg／mL后，清除率达到了90％以上，而浓度再继续增加，清除率基本保持不变。皂化前后的提取物相比较，在相同浓度时 E 样品要比 S 样品清除DPPH ·能力强，这可能是由于虾青素酯更容易与 DPPH ·的孤对电子配对。在实验所选样品浓度范围内，E 和 S 对 DPPH ·自由基的清除能力都是随着样品浓度的增加而增强的，与 BHT 相比，在浓度为0．05mg／mL时，E 和 S 的清除能力很低，只有5％ 左右；当浓度为0．2mg／mL时，E 和 S 对 DPPH ·自由基清除率分别为39．25％和16．94％ ；当浓度为0．3mg／mL时，清除率分别增加到77．42％和26．15％ 。 2．3 还原力 还原力的测定是检验样品是否是良好的电子供体的方法，还原力强的样品应该是良好的电子供应者，它供应的电子不仅能使Fe3+ 还原为Fe2+ ，也可以与自由基反应。还原力的测定是用来评价抗氧化剂活性的常用方法。BHT 以及 E、S 样品的还原力测定结果如图4所示。
由结果可以看出，在本实验使用的浓度范围内，BHT、E、S 的还原力都是随着浓度的增加而增强的，但是 BHT 浓度增加到1．0mg／mL后，还原力的增加就很慢了。E 和 S 相比，在相同浓度下 S 的还原能力比 E 稍强，但相差不多( 3．2％ - 8．9％ )。 3 结论 3．1 雨生红球藻提取物的抗亚油酸氧化能力 通过 FTC 法和 TBARS 法测定，雨生红球藻的虾青素提取物在很低浓度时就起到了良好的抗亚油酸氧化作用，而且这种作用随着浓度的增加而增强，当浓度为0．2mg／mL时，两种样品的过氧化抑制率分别达到了84．07％ 和81．54％ 。E 和 S 比较，在相同浓度时 E 抗亚油酸氧化能力比 S 强。 3．2 雨生红球藻提取物的清除DPPH·自由基能力 实验中所用提取物对 DPPH ·的清除率与同浓度的 BHT 相比要低的多，E和 S 样品对 DPPH ·的清除率和浓度成剂量关系，浓度小于0．3mg／mL时，对DPPH ·的清除率不高；当浓度为0．3mg／mL时，清除率分别增加到77．42％ 和26．15％ 。同浓度的 E 和 S 相比，E 对 DPPH ·的清除能力比 S 强。 3．3 雨生红球藻提取物的还原力 E 和 S 的还原力均随着浓度的增加而增强，E 和 S 相比，在相同浓度下 S的还原能力比 E 强，但相差不多( 3．2％ - 8．9％ )。 |
|
|
