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预要测序，必先建库！ 建库固然可以委托给公司进行，可是从质量控制、流程管理和赶进度等种种因素考虑，笔者还是强烈推荐大家自己建库呢~ 关于建库外包委托过程中可能出现的问题，大家可以看之前的帖《【好文共赏】宏基因组实验的那些坑-16S扩增子建库方法的各影响因素》 实现自己建库，其实说难也一点不难，无非是选择一款合适的建库试剂盒，然后按照protocal操作罢了。 只是目前市面上的建库试剂盒种类繁杂，有国产的，有进口，有扩增的，有不需要扩增的，有打断的，有不需要打断的，我们到底该如何选择呢？ 到底哪种才是最适宜我们的建库试剂盒呢？ 很简答，自问自答以下十个问题，你自然能获得答案。 第一问 需要建库的样本是DNA，还是RNA？ DNA建库和RNA建库原理截然不同！ 目前市面上主流的测序仪，无论是二代illumina、BGIseq，还是三代的Pacbio，其测序原理都是针对DNA的！ 因此对于RNA测序，建库过程中反转录这一步必不可少。 如果您的样本是RNA，或者您需要研究的对象是转录组，那么务必选择针对于RNA的建库试剂盒！一般此类试剂盒都会在名称中显著标注RNA的，一点不难找。 第二问 需要测序的样本究竟是某种扩增子，还是所有DNA片段？ 扩增子测序，是指对样本DNA中某一种特定的核酸片段利用引物扩增的方法抓取出来后，再继续进行测序的方法。常见的应用如16S扩增子测序和ITS扩增子测序。相比于直接进行所有DNA片段的测序，扩增子测序有一个通过PCR的信号放大作用，能够更好的抓取目标片段，并去除宿主DNA（如人）。目前，16S扩增子测序已被较普遍的应用于临床样本和环境样本的微生态调查和病原菌筛查等工作。 扩增子测序除敏感性高外，其另一个优点是建库成本较为便宜。 如果想了解该方法更多细节，可参照前贴《高通量测序DNA样本建库方法（3）：扩增法》 然而，有一利就有一弊，虽然扩增子测序拥有敏感度高和成本便宜的优点，其缺点也同样显著。 缺点1：只能针对某一类物种。如16S扩增子，只能针对细菌，不能涵盖真菌、真核生物等。 缺点2：信息量有限。一个基因的扩增子能揭示的问题有限，如16S扩增子测序研究，一般只能回答样本中有什么物种，却不能回答这些物种的耐药性或致病性等问题。 到底选择扩增子测序还是所有DNA一起测序，还是要根据您的科研目的来决定了~ 第三问 计划采用哪个测序平台进行测序？ 您是打算用二代测序，还是三代测序呢？ 二代测序优点是：通量大，价格相对便宜。 三代测序的优点是：读长长，容易拼接成基因组完成图，但价格较贵。 即使同为二代测序平台，也有illumina、BGIseq、Iontorrent等厂家的区别，不同厂家的测序平台的建库试剂盒的选择也截然不同，好在一般在试剂盒适用性上有明显标注，还是比较好区分的。 第四问 计划采用哪种样本打断方法？ 二代测序由于其测序读长较短的特点，在建库过程中需要把样本DNA打断成合适长度的片段（一般为300~700bp）。目前的打断方法主要分为三种（1）超声波打断法；（2）酶打断法；（3）PCR扩增片段选择法。 这三种不同打断方法所对应的建库试剂盒各不相同，其特点和适用性也不相同。详情可以参照前贴： 第五问 DNA起始浓度 即使是相同厂家的各款建库试剂盒，其适用性也有区别。一个比较重要的分类方法，就是基于DNA起始浓度分类。 以下图的某厂家的三款建库试剂盒为例，如橙线标注，其所需的起始DNA量分别为50ng、5ng、1ng。 那么对于难以获得高浓度DNA的样本，如血清、水、珍惜样本等，就需要优先采用适用于微量起始样本建库的试剂盒（如图中所示的试剂盒3）。 第六问 拟计划建库的样本数，即所需试剂盒的规格 目前市面上的建库试剂盒一般分为24rxn和96rxn两种规格，即可适用于24个样本的建库实验和96个样本的建库实验。 前者总价低，但单个样本均价高。 后者总价高，但平均下来，每个样本所需的价格低。 到底选哪种，还是要看您计划建库的样本数来决定了。 第七问 计划一次上机的样本数，即Barcode的规格 Barcode，即标签，是在建库过程中插入DNA片段，用于区别样本和样本间的分子标志。一般建库试剂盒中不包含，需额外采购或合成标签试剂盒。 根据计划上机的样本数，所需的标签试剂盒种类也会相应变化。例如，一次上机仅测序一个样本，那么就不需要配套额外的标签试剂盒。如果一次上机需要测序少数的样本（2~24个），那么可选用24规格的标签试剂盒。如果上机的样本数更多，则需选择更大规格（如96规格）的标签试剂盒。 第八问 进口的or国产的 早期的建库试剂盒大多是进口的，这两年国产的建库试剂盒也逐渐成熟。整体来说，还是进口的贵，国产的便宜。 第九问 配套试剂是否准备齐全 除了建库试剂盒，整个建库过程还需要很多额外的耗材和试剂需要准备。 例如，假如是采用打断法建库，你需要额外配置适用于打断仪的打断管。 假如建库过程中包含磁珠纯化，还需要采购Ampure纯化磁珠。 假如protocal中包含定量过程，你需要Qubit或RT-PCR的配套试剂（取决于你采用哪种定量方法）~ 这些准备虽然琐碎，但完成整个实验缺一不可，建库实验开始前还需仔细检查配备。 第十问 如何完成文库质控 笔者强烈推荐自己做文库质控，即使是外送测序，自己做质量控制也更为可控。文库的质量控制主要分为定量和定性两种。 定量：看文库的浓度够不够，一般采用Qubit或RT-PCR方法。 定性：看文库的片段长度是否合适，一般采用安捷伦2100或类似产品。 更多详细方法介绍，可参照前贴 啰里啰嗦一大堆，看似复杂，其实简单。几个问题，请君自问自答，自然会对所需的建库试剂盒的种类了然于心。 希望大家每一天的实验都能顺心如意 您的建库实验过程中，有什么心得体会或者经验与大家分享吗？ 欢迎留言，大家共获其益 每一天获得一点微小的收获和进步。小确幸的科研也很好。与君共勉！ |
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