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测序上机前的最后一步也是重要一步，就是文库定量。 适中的文库浓度非常重要！决定了测序实验的成败。 测序下机数据的多少直接和文库的量相关。文库量多，则生成的簇多，下机数据中的read数则多。 同样价格的一个试剂盒，我们自然是希望能够得到更多的数据，但是！ 过犹不及！文库上机绝对不是多多益善，当文库量超过一个极限时，测序会爆掉，即完全失败，所有数据都拿不到。 爆掉的原因，即文库中的几个序列在芯片上长到了一起，彼此间的信号互相影响，使机器无法读取。就如同一片森林，树木长的过于密集，互相遮挡，影响了彼此的生长。 因此，适中的文库浓度非常重要！非常重要！非常重要！ （重要的事情说三遍！） 那么文库定量如何做呢？ 现在主流的方法有2种：Qubit和qPCR方法 Qubit方法的优点是：快速！一个样本几秒即可得到结果，结果直接读取，直观。但是缺点是，检测的为样本中所有的核酸，也包含了未连接接头的核酸片段，因此不如qPCR方法准确。详细介绍可见： Qubit-文库构建兵器谱之“孔雀翎” qPCR方法：准确！ 原理上就是PCR，首先借助标准品建立标准曲线，然后利用同样的条件对文库开展PCR实验，基于CT值换算文库的浓度。整个流程耗时也不算长，大约一个半小时的时间内可以完成对96个样本进行批量定量！缺点是：文库定量前需要先稀释，且相对于Qubit定量时间较长！ 那么我们到底应该采用何种方法呢？ 成年人的选择，我们都要！哦呵呵呵呵~~~ 文库爆掉常见之坑：你掉下过去几个？ 坑1：换算错误。从ng换算成nM的过程中，或者稀释的过程中换算出错，造成文库爆掉~ 坑2：小片段过多。由于文库中出现较多的小片段，影响定量结果，造成爆掉~ 坑3：文库浓度波动。由于取样不准或者其他因素，定量时的文库浓度和实际文库浓度有差异。 还有其他坑吗？欢迎分享惨痛经验，互相提醒，避免大家掉坑~ 每一天获得一点微小的收获和进步。小确幸的科研也很好。与君共勉！ |
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