【原】Miseq二代测序仪上机操作指南（图文版）

MiSeq上机操作规程

1.目的

规范MiSeq的使用操作、以及维护操作

2.适用范围

此SOP适用于MiSeq测序平台的操作

3.操作程序   

3.1 文库变性稀释

3.1.1. 20μl 1N NaOH + 80μl 超纯水，得到0.2 N NaOH。

3.1.2. 涡旋震荡3-5秒钟，瞬时离心。重复一次。

3.1.3. 5μl 4 nM或2 nM文库 + 5μl 0.2 N NaOH。

3.1.4. 涡旋震荡3-5秒钟，瞬时离心。重复一次。

3.1.5. 室温变性5-10分钟。

3.1.6. 加冰预冷的HT1 990μl。

3.1.7. 涡旋震荡5-10秒钟，瞬时离心。重复一次。

3.1.8. 根据文库类型和优化的上机浓度，按如下表格进行第二次稀释：

a. 4 nM起始浓度文库

上机浓度	6 pM	8 pM	10 pM	12 pM	15 pM	20 pM
20 pM文库	180μl	240μl	300μl	360μl	450μl	600μl
冰预冷HT1	420μl	360μl	300μl	240μl	150μl	0μl

b. 2 nM起始浓度文库

上机浓度	6 pM	8 pM	10 pM
10 pM文库	360μl	480μl	600μl
冰预冷HT1	240μl	120μl	0μl

3.1.9. 如需添加PhiX，将PhiX按同样方式变性稀释后，按如下方式将PhiX与待测文库混合：

	碱基均衡文库（1% PhiX）	碱基不均衡文库（≥5% PhiX）
变性、稀释后的PhiX标准文库*	6μl	30μl
变性、稀释后的待测文库	594μl	570μl

3.1.10. 稀释、变性后的文库置于冰上或2-8℃冰箱，准备上机使用。

3.2在Local Run Manager（LRM）中创建run

3.2.1． 打开网页浏览器（Chrome或Chromium），输入http://localhost/#/login，登录LRM。

3.2.2． 点击“Create Run” -> 选择合适的module创建一个重测序run（ 以Resequencing为例）。

3.2.3． 设置run参数后。点“Save Run”保存。

3.2.4． 新生成的run可以在LRM下看到。

3.3 MiSeq上机

3.3.1. 解冻-20℃测序试剂夹盒。使用室温去离子水，水位接近，但不超过最高水位线。MiSeq v3试剂盒约60-90分钟完全解冻；MiSeq v2试剂盒用约60分钟。

3.3.2. 确认试剂完全解冻后（特别注意1、2和4号试剂），上下翻转10次。翻转过程不宜过快，以确保试剂充分混匀。

3.3.3. 检查试剂中是否有气泡，如有气泡，可通过轻拍夹盒来消除气泡。

3.3.4. 解冻的试剂如不马上使用，请临时置于2-8℃冰箱保存，保存时间不超过6小时。最好可以马上上机。

3.3.5. 将600μl稀释变性好的文库样品加入到第17号（标有Load Samples字样）试剂槽位。

3.3.6. 检查试剂中是否有气泡，如有气泡，可通过轻拍夹盒来消除。

3.3.7. 重启MiSeq。

3.3.8. 进入MiSeq控制软件界面后，选择“SEQUENCE”。

3.3.9. 通过LRM或Sample Sheet选择run。

3.3.10. 准备流动槽。

3.3.11. 装入流动槽。

3.3.12. 装入PR2试剂和废液缸，并确定废液缸已清空。

3.3.13. 装入试剂夹盒，并确定已混匀、已加样品，且试剂管底无气泡。

3.3.14. 运行前仪器自检。

3.3.15. 自检通过后点击“Start Run”，开始测序。

3.3.16. 测序结束后，进行Post-Run清洗。

a. 通过梯度稀释配置500ml 0.5% Tween 20洗液。

a) 5ml 100% Tween 20 + 45ml 超纯水，上下颠倒充分混匀，得到10% Tween 20溶液。

b) 25ml 10% Tween 20 + 475ml 超纯水，上下颠倒充分混匀，得到0.5% Tween 20溶液。

b. [可选] 通过梯度稀释配置1ml 0.01% NaClO洗液。

a) 36μl 5% NaClO + 864μl超纯水，移液器吹吸混匀，得到1:25 NaClO稀释液。

b) 50μl 1:25 NaClO稀释液 + 950μl超纯水，移液器吹吸混匀，注入 MiSeq 试管（货号MS-102-9999）。

c. 清洗托盘的每个孔位加6ml 0.5% Tween 20洗液；500ml洗瓶内加350ml 0.5% Tween 20洗液。

d. [可选] 将装有 0.01% NaOCl 清洗液的 MiSeq试管插入洗涤托盘中的 第17号槽位， 直至试管管颈与托盘齐平。

e. 点击“Start Wash”，冰箱中吸管会自动提起，“Perform optional template line wash”选项根据是否做NaClO清洗来确定是否选取。

f. 分别用清洗托盘和500ml洗瓶替换试剂夹盒和PR2试剂。

g. 放下PR2吸管，关闭舱门，点击“Next”开始清洗。

3.4 仪器维护

3.4.1. 从仪器控制软件主页中选择“Perform Wash”，再选“Perform Maintenance Was”。

3.4.2. 通过梯度稀释配置500ml 0.5% Tween 20洗液。

a) 5ml 100% Tween 20 + 45ml 超纯水，上下颠倒充分混匀，得到10% Tween 20溶液。

b) 25ml 10% Tween 20 + 475ml 超纯水，上下颠倒充分混匀，得到0.5% Tween 20溶液。

3.4.3. 清洗托盘的每个孔位加6ml 0.5% Tween 20洗液；500ml洗瓶内加350ml 0.5% Tween 20洗液。

3.4.4. 选择 “Next”，开始清洗。

3.4.5. 重复第2-6步骤两次。

3.4.6. 完成清洗。

3.5校验

由购买公司派专人进行一年一次的校验

3.6记录

记录仪器使用时间和维护时间

3.7支持性文件

MiSeq使用说明书

版权说明：以上文档素材来源于illumina官方网站，致谢illumina工程师技术支持

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