整合网络毒理学和网络药理学的合欢皮抗焦虑毒效机制探究

摘要：目的 通过整合网络药理学和网络毒理学，探究合欢皮抗焦虑的治疗机制和导致肾损伤的致毒机制。方法 基于ETCM、TCMID和BATMAN-TCM数据库收集合欢皮化学成分，并通过文献检索对合欢皮的生物活性成分进行筛选和补充。基于PharmMapper、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM和ETCM数据库获取成分对应靶点；在CTD和GeneCards数据库中检索得到焦虑症和肾毒性相关靶点，分别与药物靶点取交集得到药效和毒性共有靶点；将共有靶点导入STRING数据库进行蛋白互作分析，在Cytoscape软件进行可视化分析；采用STRING数据库进行GO生物分析和KEGG通路富集分析。结果  筛选得到生物活性成分共51个，对应靶点747个，其与焦虑症和肾毒性交集靶点分别为134、144个，相关通路分别为173、184条。合欢皮可通过调控cAMP、RAS、MAPK、雌激素、催乳素、甲状腺激素和TNF等信号途径治疗焦虑症；其肾毒性的产生与BCL2、SOD靶点以及VEGF、MAPK、mTOR、PI3K-Akt、HIF-1、TNF、Toll-like、NOD-like等信号通路关系密切。结论  发现合欢皮抗焦虑成分主要为木脂素及黄酮类化合物，致毒成分主要为皂苷类化合物。抗焦虑作用可能通过影响神经递质5-HT以及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴、下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴发挥作用，并通过诱导炎症反应、缺氧状态、异常凋亡、氧化应激反应和自噬失衡产生肾毒性。

焦虑症（anxiety disorder，AD）主要分为广泛性焦虑（generalizedanxiety disorder，GAD）和惊恐障碍（panic disorder，PD）2种。目前治疗焦虑症的一线药物包括苯二氮类、选择性5-羟色胺（5-HT）的再摄取抑制剂、去甲肾上腺素等^［1］。苯二氮类药物治疗效果良好，但其不良反应和后遗效应严重，且长期使用会产生耐受性和依赖性^［2］。焦虑症患者的病程往往较长且反复发作，这些抗焦虑药物存在着广泛的不良反应，如乏力、头昏、嗜睡和记忆力减退等，长期使用副作用较大，对患者的工作生活各方面带来负面影响的同时也造成了很大的经济负担^［3］。因此，具有抗焦虑作用的中药具有较大的开发潜力，研究安全、高效、低毒的天然抗焦虑药物具有深远意义。

合欢皮为豆科植物合欢Albizia julibrissin Durazz.的干燥树皮，其性甘、平，归心、肝、肺经，具有解郁安神、活血消肿等功效，主要用于治疗心神不安，忧郁失眠，肺痈，疮肿，跌扑伤痛等疾病^［4］。最早在《神农本草经》^［5］中记载合欢皮具有“令人欢乐无忧”“久服轻身明目得所欲”的功效。熊永豪等^［6］研究发现2.5 g/kg合欢皮水提液对小鼠具有一定的抗焦虑作用，其作用机制与提高小鼠脑γ-氨基丁酸（GABA），降低脑内谷氨酸（Glu）和5-HT的含量有关。田微^［7］和冯波等^［8］研究发现，合欢皮抗焦虑的主要成分为木脂素类化合物，且合欢皮对脑组织中单胺类神经递质的调节作用相比于氨基酸类、乙酰胆碱神经递质更为显著。这些研究表明合欢皮具有较好的抗焦虑作用，然而合欢皮存在一定的毒性。合欢皮总皂苷口服致毒剂量（7.5 mg/kg）具有肾毒性，促使肾小球细胞凋亡，可能与其降低肾组织的抗氧化能力，改变凋亡相关基因的表达，升高环氧化酶-1（COX-1）的表达有关^［9］。因此，借助网络药理学及网络毒理学，认识合欢皮的药效和毒性物质基础及作用机制，探究其用药的安全范围具有一定的临床意义。

网络药理学是指在系统生物学理论的基础上，通过建立药物-靶点、疾病-靶点之间的关系预测模型，整合两者间的相互作用网络，从而分析药物在各网络模块中与特定节点之间的相互作用，从整体性、系统性的角度去探究药物与潜在靶点之间作用关系的方法^［10］。网络毒理学的方法与网络药理学基本一致，是指构建特定的网络模型以描绘药物的毒理学性质，从而了解药物的毒副作用，预测药物的毒性成分^［11］。基于以上研究现状，本研究整合网络药理学和网络毒理学，初步阐述了合欢皮抗焦虑的治疗机制和导致肾损伤的致毒机制，旨在找到合欢皮合理用药的范围，在降低肾毒性的同时达到抗焦虑的治疗效果，为临床用药安全性评估提供参考。

1　材料与方法

1.1　合欢皮化学成分的收集

从中医药百科全书数据库（ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）、中药综合数据库（TCMID，http：//119.3.41.228：8000/tcmid/）和BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中检索合欢皮化学成分，构建合欢皮化学成分数据库。通过文献检索对具有药理作用的化学成分及入血成分进行补充和筛选，得到合欢皮的生物活性成分。

1.2　合欢皮活性成分-靶点库的建立

PharmMapper数据库^［12］（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）是一个药效团匹配与潜在识别靶标的平台，基于TargetBank、DrugBank、BindingDB和PDTD数据库进行小分子和特异靶点受体之间的相互作用分析。SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）基于Daylight FP2的分子指纹方法，并采用Tanimoto系数定义的相似度度量方法预测生物活性分子靶点。

利用PubChem数据库检索合欢皮活性成分，将化合物的2D结构保存为SDF格式，数据库中未收录的活性成分使用ChemDraw 18.0软件进行绘制，并保存为SDF格式。将SDF格式文件导入PharmMapper数据库中，检索条件中筛选目标设置为“Human ProteinTargets Only”，选取每个活性成分排名前100的靶点；在SwissTargetPrediction数据库中导入活性成分的SDF格式文件，自动转化为Canonical SMILES形式，预测活性化合物的潜在靶点，检索条件中物种设置为“Homosapiens”，剔除可能性为0的靶点，从而剔除没有相关信息的化学成分。导入UniProt（https：//www.uniprot.org/）中获取靶点标准基因名，并用BATMAN-TCM、ETCM中已有的靶点进行补充，去除重复项，得到合欢皮活性成分-靶点库。

1.3　焦虑症、肾毒性相关靶点库的建立

在比较基因组学毒理数据库Comparative Toxicogenomics Database（CTD，http：//ctdbase.org/）中输入关键词“焦虑症（anxiety disorders）”筛选已报道的、与焦虑症相关的，标记有“marker/mechanism”的基因；在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中输入关键词“anxiety disorders”，将得到的靶点根据“relevance score”采用中位数法进行筛选。将两个数据库得到的靶点去除重复基因和假阳性基因，得到焦虑症相关靶点。

在GeneCards数据库中输入关键词“nephrotoxicity”“renal toxicity”收集和肾毒性相关的基因，将得到的靶点根据“relevance score”采用中位数法进行筛选，得到肾毒性相关靶点。

1.4　合欢皮“活性成分-靶点网络”的构建

在Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中，将药物潜在靶点分别与焦虑症和肾毒性的作用靶点进行映射比对，获取交集靶点，得到合欢皮治疗焦虑症和导致肾毒性的潜在作用靶点。

利用Cytoscape软件中的相关分析程序，对合欢皮中生物活性成分和作用靶点特征进行分析，明确网络中较为重要的节点。查阅文献并分析重要节点间的相互作用。

1.5　交互网络的构建和分析

STRING数据库收录了计算、实验、文献等方法的蛋白相互作用关系，是目前常用的构建蛋白相互作用（PPI）网络的数据库；Cytoscape3.6.1软件可用于计算网络中所有节点的拓扑参数，一般可以选取连接度（degree）、中介中心度（betweenness）、接近中心度（closeness）等参数作为核心节点的筛选条件来构建与分析成分-作用靶点网络。网络图中“节点（node）”代表合欢皮中的活性成分和作用靶点，“边（edge）”代表活性成分和作用靶点间的相互关系。

将共有靶点输入STRING数据库（https：//string-db.org/），限定物种为人源，获取蛋白相互作用关系，将其保存为TSV格式文件，导入Cytoscape软件进行可视化。

1.6　基因本体论（Gene ontology，GO）生物功能过程和KEGG代谢通路富集分析

GO是用于描述基因产物功能并且广泛应用于生物信息学领域的一个本体^［13］，通过生物途径（Biology Process）、分子功能（Molecular Function）、细胞成分（Cellular Component）3个角度对基因进行分析。京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）用于从基因组和分子水平信息中了解生物系统的高级功能和效用，以整合和解释基因组测序和其他高通量实验技术得到的大规模数据集。

将上述共有靶点导入STRING在线数据库进行GO生物分析与KEGG通路分析。并根据命中的靶点数目进行排序，筛选排名靠前的生物过程或通路，用GraphPadPrism 5.0 软件进行绘图。

2　结果

2.1　合欢皮成分的筛选

在ETCM数据库中得到合欢皮已报道成分36个，TCMID数据库中47个，BATMAN-TCM数据库中15个，去除重复项之后，共收集到47个化学成分。同时通过文献检索，对于药理作用明确的化学成分以及入血成分作为候选活性成分，最终筛选得到生物活性成分共51个，具体信息见表1。经PharmMapper、SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM、ETCM数据库筛选，共获得合欢皮成分对应靶点747个。

2.2　焦虑症、肾毒性相关靶点的筛选和构建

通过检索CTD、GeneCards数据库得到焦虑症相关作用靶点，分别检索得到53、654个靶点，删除重复靶点，共计得到677个焦虑症相关作用靶点。通过检索GeneCards数据库得到肾毒性相关作用靶点770个，将得到的药物潜在靶点与疾病靶点进行比对，得到合欢皮成分和焦虑症交集靶点134个，得到合欢皮成分和肾毒性交集靶点144个。

2.3　蛋白相互作用（PPI）网络构建及分析结果

将活性成分-焦虑症共有靶点输入STRING数据库，限定物种为人源，获取蛋白相互作用关系，将其保存为TSV格式文件，导入Cytoscape软件进行可视化，除去1个孤立靶点，共涉及133个节点，1 575条边，蛋白互作的拓扑参数分析数据见表2，结果见图1-A。活性成分-肾毒性共有靶点分析结果共涉及144个节点，2 209条边，蛋白互作的拓扑参数分析数据见表3，结果见图1-B。

2.4GO生物分析与KEGG通路分析

在合欢皮抗焦虑的GO分析中，生物途径共得1879条Go-terms，主要涉及“生物质量调控”“对含氧化合物的反应”“对有机物的反应”等相关作用途径；分子功能共捕获234个Go-terms，主要与“信号受体活性”“分子传感器活性”“蛋白质结合”等较为密切；细胞成分共富集得到163个Go-terms，主要参与“细胞膜上的膜筏”“细胞质膜部分”“投射神经元”等相关定位；KEGG通路分析中发现173条相关通路，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Ras、第二信使环磷酸腺苷（cAMP）、雌激素、催乳素、甲状腺激素、TNF等相关通路与合欢皮抗焦虑作用相关，结果见图2。

致肾毒性的GO分析中，生物途径共得到2034条Go-terms，主要涉及“化学反应”“对有机物的反应”“对含氧化合物的反应”等相关作用途径；分子功能共捕获223个Go-terms，主要与“相同蛋白结合”“催化活性”“蛋白质结合”等较为密切；细胞成分共富集得到150个Go-terms，主要参与“细胞质部分”“细胞质”“胞外区”等相关定位；KEGG通路分析中发现184条相关通路，PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、FoxO、血管内皮生长因子（VEGF）、TNF、Toll-like、NOD-like、mTOR、Jak-STAT等相关通路与合欢皮致肾毒性关联密切，结果见图2。

3　讨论

3.1　合欢皮抗焦虑药效物质基础

合欢皮具有抗焦虑作用，其发挥作用的成分主要为木脂素类成分，部分为黄酮类成分。具体为硫黄菊素、木犀草素、维生素C、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖、合欢皂苷C1、鞣质等化合物。

硫黄菊素是一种橙酮类化合物，能够通过活性氧（ROS）依赖机制抑制神经元死亡^［41］，具有抗氧化和保护神经细胞的作用，能够预防或治疗焦虑症^［49］。木犀草素是一种黄酮类化合物，具有明显的中枢神经系统活性。木犀草素不通过调节GABA_A受体来产生抗焦虑作用^［50］，Coleta等^［51］通过体外实验也证明其对苯二氮受体（BDZ-R）的亲和力较低。然而不能排除木犀草素的代谢物可能在体内表现出更高的BDZ-R亲和力，从而通过GABA能机制产生明显的抗焦虑作用。

2，6-二甲氧基-4-羟基苯酚-1-O-D-吡喃葡萄糖苷、大豆苷、（-）-丁香树脂酚、（-）-丁香树脂-4，4′-bis-β-D-葡萄糖苷均为合欢皮抗焦虑部位的入血成分^［36］，Liu等^［39］证实（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖具有抗焦虑作用。（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷以原型成分入血^［35］，能促进细胞增殖，减少乳酸脱氢酶释放，抑制凋亡，提高线粒体膜电位值，降低细胞内钙浓度，上调环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）、脑源性神经营养因子（BDNF）和Bcl-2，下调Bax和Cyt c蛋白表达水平，降低Caspase-3活性，具有神经保护和抗凋亡的作用，其作用机制与抑制线粒体凋亡途径和激活CREB、BDNF途径有关^［34］。

此外，大剂量的缓释维生素C可以减轻焦虑^［52］；合欢皂苷C1可能通过5-HT1A和GABA_A-BDZ-R系统介导起到抗焦虑的作用^［48］。鞣质能够通过调节神经递质减轻GABA拮抗剂引起的焦虑样行为^［53］。

本研究筛选得到的51个活性成分中，上述7个成分已被证实具有抗焦虑作用，这些成分进一步作用于AKT1、ALB、IL6、TP53、APP、MAPK1等核心靶点，从而调节相关通路，起到抗焦虑的作用。另外根据连接度值和共有靶点数量筛选出的其他成分中，异奥卡宁、3'，4'，7-三羟基黄酮、（-）-丁香树脂酚、大豆苷、（-）-丁香树脂-4，4'-bis-β-D-葡萄糖苷、2，6-二甲氧基-4-羟基苯酚-1-O-D-吡喃葡萄糖苷等成分具有潜在的抗焦虑作用，后续应进行相关的细胞生物学和分子药理学实验。

3.2　合欢皮抗焦虑作用机制分析

焦虑症是一种多因素发病机制的疾病，主要的生化病理机制涉及神经递质、内分泌系统、免疫系统^［54］等方面。神经递质假说主要包括5-HT系统功能亢进、去甲肾上腺素（NE）系统功能亢进、GABA功能不足等，其中5-HT与合欢皮抗焦虑作用关联较大。

5-HT调节焦虑的作用与cAMP信号通路、RAS信号通路和MAPK信号通路关系密切。5-HT（1A）受体是5-HT受体的亚型，它通过开放G蛋白门控内向整流钾通道，负性调节cAMP依赖性信号转导，抑制神经元活动^［55］。研究表明，焦虑的调节是通过细胞内cAMP进行的，cAMP通过串扰激活RAS-MAPK信号通路诱导焦虑产生^［56］。MAPK信号通路涉及到多级蛋白激酶的级联反应，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）^［57］和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）。降低焦虑模型海马的磷酸化ERK^［58］，调节JNK/MAPK通路^［59］，抑制海马神经元p38 MAPK信号通路^［60］均能达到抗焦虑作用。上述研究表明，合欢皮抗焦虑机制与5-HT及其相关通路关联性较强，且与合欢皮已有文献研究结果基本一致。

合欢皮可能通过调节内分泌系统起到抗焦虑作用。内分泌系统主要涉及下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴、下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴、下丘脑-垂体-甲状腺（HPT）轴。HPA轴被认为是应激的主要媒介，它介导促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的释放。合欢皮的作用靶点CRHR1是CRH的G蛋白偶联受体，能够促进腺苷酸环化酶的激活，导致细胞内cAMP水平升高，抑制钙通道CACNA1H的活性，起到抗焦虑作用。

HPG轴调节性激素的分泌，严重心理应激会导致HPG轴系统抑制或损伤，从而引起性激素释放失衡^［61］。雌激素水平的下降以及催乳素（PRL）水平升高都与焦虑的增加有关。雌激素受体（ER）亚型不同，对焦虑影响作用不同，ERα具有致焦虑作用、ERβ具有抗焦虑作用，G蛋白偶联ER被称为雌激素膜受体GPR30，能够调节焦虑样行为。这些受体亚型主要是通过HPA轴、催产素和5-HT能系统发挥作用^［62］。雌激素缺乏引起的焦虑样行为与炎症有关^［63］，雌激素缺乏导致NLRP3炎性小体激活从而导致焦虑，NLRP3炎症小体可能是雌激素缺乏相关情感障碍的潜在治疗靶点^［64］。焦虑症患者的PRL水平升高后激活PRL受体亚型来调节特定的神经回路并调控焦虑状态^［65］。合欢皮可能通过调节雌激素和PRL水平从而治疗焦虑症。

HPT轴调节焦虑的作用涉及到甲状腺激素信号通路，甲状腺激素通过甲状腺激素受体（TR）α和β亚型发挥作用，TR基因敲除和转基因TRα1基因敲除小鼠表现出焦虑样行为，成年期雄性小鼠甲状腺功能减退症产生轻微的焦虑效应^［66］。可以认为合欢皮抗焦虑作用可能通过HPT轴上相关激素发挥作用。

免疫系统的功能紊乱可能是合欢皮抗焦虑机制的一部分。促炎性细胞因子包括白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，都与临床焦虑症的病因有关^［67］，合欢皮可能通过TNF通路起到抗焦虑作用。

上述结果表明，合欢皮与神经递质的相关活动关系密切，这与已有研究结果相符。内分泌系统与免疫系统的相关活动也可能是合欢皮抗焦虑作用机制的一部分，然而尚未有相关实验研究证明这一点，这很可能成为探索合欢皮抗焦虑机制的下一个方向。此外，对于上述讨论中未提及的通路——ErbB信号通路、钙信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路、mTOR信号通路、cGMP-PKG信号通路的抗焦虑作用的研究报道较少，后续需进行实验研究，可为今后深入研究抗焦虑作用潜在靶点的分子机制研究提供线索。

3.3　合欢皮致肾损伤毒效物质基础

文献调研发现，合欢皮总皂苷具有毒性，高剂量的合欢皮总皂苷对大鼠血液及循环系统有一定的毒性作用^［68］，对小鼠的呼吸系统^［69］、神经系统^［70］和肾^［9］有一定毒性，表现为肾细胞凋亡数目增多，肾小球细胞凋亡数目尤为明显。合欢皮总皂苷对雌性小鼠的卵巢和子宫造成损害^［71］，对雄性小鼠具有抗生育作用^［72］，具有生殖毒性。合欢皮总皂苷可能为合欢皮中主要毒性物质，但具体的毒性物质尚不明确。

从合欢皮的化学成分并结合目前已有文献发现，合欢皂苷J1、J5、J8、J9、J12、J13、J16、J18、J19、J21、J22、J25、J41-46、Ι和lebbeckoside C具有肾毒性，这为合欢皮具体致毒成分的研究提供了理论依据。此外，金合欢皂苷元b尚未有相关文献表明其具有毒性，但本研究推测其可能为毒性成分，后续需要进行进一步的毒理学实验验证。

3.4　合欢皮致肾毒性作用机制分析

从肾毒性分子机制角度进行分析，合欢皮致肾毒性与以下靶点和信号通路产生的效应相关。VEGF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路均与炎症反应相关；PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路参与自噬失衡的产生；HIF-1信号通路与缺氧相关；TNF信号通路、BCL2靶点与凋亡结局的产生有关；Jak-STAT信号通路、FoxO信号通路、SOD靶点与氧化应激反应相关。

抑制VEGF信号及其下游通路是治疗肿瘤的一种常见策略，但相关的肾毒性依然是一个值得关注的问题。VEGF信号通路的关键下游信号通路包括MAPK/ERK1/2、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）。抑制RAF/MAPK/ERK与肾小管间质损伤有关，抑制VEGF后，eNOS的减少是内皮损伤的潜在机制^［73］。mTOR是PI3K-Akt信号通路的一部分，抑制mTOR的肾毒性与VEGF信号的减少以及自噬途径的破坏有关。VEGF-A过度表达或还原与多种肾小球疾病相关联，这表明肾脏中VEGF信号通路的调节对肾小球的发育以及在稳态和疾病中维持成熟的肾小球功能至关重要^［74］。除缺血性急性肾功能衰竭之外，缺氧在肾毒性急性肾损伤、放射性造影剂肾病和急性肾小球肾炎的发生中也起着至关重要的作用^［75］。缺氧诱导因子（HIF）-1α蛋白是一种已知上调VEGF-A的蛋白质，VEGF-A下调与HIF-1α表达的丧失相关，HIF-1α表达在组织缺氧增加时发生^［76］。合欢皮总皂苷抑制肿瘤细胞的细胞毒活性可能主要是通过VEGF介导的，其对VEGF的抑制作用可能是导致肾毒性的主要机制，这为后续的研究提供了参考。

Toll样受体（TLR）家族中，与肾毒性相关的重要靶蛋白包括TLR2^［77］、TLR3^［78］、TLR4、TLR9^［79］。其中，TLR4通过影响适应性和先天性免疫反应而触发新月体肾小球肾炎^［80］，可通过固有肾细胞产生CXCL1和CXCL2诱导抗体介导的肾小球肾炎^［81］。TLR4在肾实质细胞上可能激活p38 MAPK通路，导致炎性细胞因子（如TNF-α）的增加和肾损伤^［82］。跨膜TNF是肾组织损伤的重要介质，其特征是肾细胞死亡增加和肾小球内皮细胞丢失^［83］，TNF已被证明是多种药物引起肾毒性的基础^［84］。NOD样受体（NLR）识别相应配体后，能够促进NLRP3炎症小体的激活，NLRP3过度表达会导致肾损伤加重^［85］。因此，合欢皮可能通过上述信号通路影响免疫系统，从而导致炎症和肾脏损害。

合欢皮可通过影响FoxO-3和Jak-STAT的表达导致肾毒性。FOXO-3是抑制自噬的PI3K途径的下游靶点，一些预防氧化性肾损伤的药物能够上调FOXO-3基因的表达^［86］。Janus激酶/信号转导与转录激活子（Jak-STAT）在中枢性睡眠呼吸暂停（CSA）诱发的肾毒性中起关键作用^［87］。除此之外，超氧化物歧化酶（SOD）1、SOD2是评估肾毒性的肾功能生物标志物之一^［88］；与细胞凋亡关系密切的基因BCL2和BCL2L1在肾小球肾炎中mRNA的表达下降^［89］。以上研究结果与文献报道基本一致，从而初步佐证了本研究的可靠性。

3.5　安全性问题探讨

本研究发现合欢皮中主要抗焦虑成分为木脂素类化合物，主要致肾毒性成分为皂苷类化合物，与文献调研结果相符。由此可见，合欢皮抗焦虑相关成分与毒性相关成分交集较小，通过一定手段减少合欢皮中皂苷类成分保留木脂素类成分，可以有效地避免毒性。从机制角度对比，本研究发现合欢皮治疗焦虑症与导致肾毒性的机制具有较大差异，仅有MAPK信号通路和TNF信号通路重合，这表明在治疗疾病与导致毒性两个方面上，合欢皮从不同角度发挥作用，通过配伍其他中药抑制其中导致肾毒性的作用通路，可能是合欢皮减毒增效的新思路。

《中国药典》记载合欢皮的用量为6～12 g，在《中华本草》中用量为10～15 g，在《全国中草药汇编》中用量为1.5～3.0钱（7.5～15.0 g），治疗心神失眠时合欢皮常与柏子仁、白芍、龙齿、夜交藤配伍，水煎服^［90-91］。合欢皮总皂苷主要为三萜皂苷类成分，提取常采用70%～75%的乙醇进行^［92-93］；合欢皮解忧安神的主要活性成分为水溶性木脂素类成分，常使用水提取后再使用正丁醇萃取^［94］；或使用50%甲醇进行提取^［95］。2.5 g/kg合欢皮水提液对小鼠有一定的抗焦虑作用^［7］，合欢皮水提部位小鼠最大耐受量为1 343.20 g/kg，40%乙醇部位最大耐受量为1 178.58 g/kg，95%乙醇部位最大耐受量为99.94g/kg（按含生药量计算）^［96］，这表明合欢皮的主要致毒成分集中在醇提部位，水提部位的合欢皮低剂量即有较好的治疗效果，且最大耐受量高，安全范围较大。醇提部位的成分主要为合欢皮总皂苷，其对小鼠的最小致毒量为7.5 mg/kg^［97］；8 mg/kg剂量下的正丁醇部位对小鼠的肝和肾等无毒性反应，40 mg/kg时会导致器官轻微损伤^［98］。

上述研究表明，醇提合欢皮的抗焦虑效果不佳且毒性较大^［99］，临床上常使用水煎煮的方法提取，不仅一定程度上减少三萜皂苷类成分的溶出，减小肾毒性^［100］，且抗焦虑效果良好。合欢皮水提液的最大耐受量远高于治疗剂量，且有效成分和毒性成分不同，溶解度具有差异，水提取的方法能达到减毒增效的作用，故本研究认为使用合欢皮治疗焦虑症时，在合理剂量下使用安全性较高，治疗效果较好。

除此之外，需要注意合欢皮的用药禁忌，由痰热等其他因素引起的心神不安、虚烦失眠等神志异常，须适当配伍，不宜单味药服用；低血压患者不宜大量应用，妊娠期慎用，青年男性不宜大量长期服用。

3.6　本研究不足和局限性

网络药理学和网络毒理学可以快速、全面地初步揭示药物-靶点-通路-疾病间的作用关系网络，从而预测和分析靶点、信号通路和药物的作用机制，能够为后续的实验研究提供思路和方向，对中药活性成分和作用机制的研究具有一定的意义，然而本研究依旧存在许多不足和局限性。

首先，本研究纳入的合欢皮成分为目前已有研究证明的活性成分及入血成分，部分尚未研究的成分未纳入，可能存在数据库偏移的情况。PKA、CREB、BDNF和TRKB是合欢皮治疗焦虑症的潜在靶点^［35］，本研究中未预测到这些靶点；合欢皮导致肾毒性的机制可能还包括降低肾组织谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，增强环氧化酶（COX-2）的过度表达^［9］等，本研究中未预测到这些靶点，可能是计算的假阴性误差。其次，本研究还需要进行入血成分研究，需要以血清药物化学为导向，对预测结果进行完善和验证。最后，本研究未涉及实验验证，药物在体内的作用机制的确认还需要进一步通过整体动物实验进行验证。

4　结论

本研究结合网络药理学和网络毒理学，初步探索合欢皮抗焦虑成分可能为硫黄菊素、木犀草素、维生素C、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-葡萄糖苷、合欢皂苷C1、鞣质等化合物；导致肾毒性的成分可能为各类合欢皂苷（合欢皂苷J1、J5、J8、J9、J12、J13、J16、J18、J19、J21、J22、J25、J41-46、Ι和lebbeckoside C）。

合欢皮可能通过调控cAMP、RAS、MAPK和TNF等信号通路以及5-HT神经递质和HPA、HPG、HPT轴相关靶点和途径达到治疗焦虑症的作用，神经内分泌功能紊乱是合欢皮抗焦虑研究的潜在研究方向；合欢皮肾毒性的产生与BCL2、SOD靶点以及VEGF、MAPK、mTOR、PI3K-Akt、HIF-1、TNF、Toll-like、NOD-like等信号通路关系密切，通过诱导炎症效应、缺氧状态、异常凋亡、氧化应激反应和自噬失衡发挥效应。

本研究探讨合欢皮的抗焦虑作用及其导致肾毒性的安全性问题，发现合欢皮抗焦虑成分主要为木脂素及黄酮类化合物，主要致肾毒性成分为皂苷类化合物，且治疗和致毒从不同的通路及靶点发挥效应。通过合理用药能够在减少肾毒性的同时达到抗焦虑的治疗效果，为临床用药安全性评估提供参考，也为后续的药效和毒理研究提供支持。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 

来  源：梁雨璐，张洁，李忆红，解嘉琪，刘传鑫，黄建梅．整合网络毒理学和网络药理学的合欢皮抗焦虑毒效机制探究    [J]. 药物评价研究, 2021, 44(7): 1411-1424.