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摘 要：目的 探究竹叶椒Zanthoxylum armatum挥发油抗炎、镇痛的活性成分及作用机制。方法 采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）定性表征竹叶花椒挥发油成分，并借助中药系统药理学数据库分析平台（TCMSP）、PubChem、Swiss TargetPrediction和Uniprot数据库收集活性成分对应靶点。通过GisGeNET及OMIM数据库筛选炎性反应和疼痛的相关靶点，采用Cytoscape软件构建“成分-靶点-疾病”网络。借助STRING及BioGPS数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络并分析靶点组织分布，运用DAVID数据库对靶点进行基因本体论（gene ontology，GO）功能及京都基因及基因组百科全书（Kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，KEGG）通路富集分析。采用分子对接法验证竹叶花椒挥发油主要活性成分与核心靶点的相互作用。结果 从竹叶椒挥发油中鉴定成分44个，预测得到其潜在抗炎、镇痛靶点78个，关键靶点涉及前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3（muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferatoractivated receptor α，PPARA）、大麻素受体2（cannabinoid receptor 2，CNR2）等。GO分析结果表明筛选得到的靶点主要涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、质膜及酶结合等生物学过程。KEGG通路富集分析得到60条信号通路，涉及神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触及胰岛素抵抗等相关通路。分子对接结果显示竹叶椒挥发油中芝麻素、胆甾烯基豆蔻酸酯和(−)-β-花柏烯等活性成分与核心靶点具有较好的亲和能力。结论 竹叶椒挥发油中多种活性成分能够作用于PTGS2、CHRM3、PPARA等靶点，并通过多通路发挥抗炎、镇痛作用。 竹叶椒为芸香科植物竹叶椒Zanthoxylum armatum DC.的果实，具有温中燥湿、散寒止痛的功效，用于治疗脘腹冷痛、寒湿吐泻、蛔厥腹痛、龋齿牙痛等症[1-2]。以其生药材为主要原料制备而成的竹叶椒片临床常用于治疗急性阑尾炎、腹痛及胃痛，疗效显著[3]。竹叶椒传统功效与现代临床研究均表明其具有抗炎、镇痛作用。挥发油是竹叶椒的主要活性组分之一，包含烯烃、烷烃、醇类、酯类等多种成分。现代药理学研究表明，竹叶椒挥发油能够显著抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、环氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表达[4]。网络药理学是系统生物信息学研究的重要工具，利用网络可视化方法分析疾病与药物及靶点间复杂的相互作用关系，具有整体性和系统性特点，目前已广泛用于预测中药调控机体生物网络的作用机制[5]。本研究整合气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析与生物信息学技术，探究竹叶椒挥发油主要活性成分的作用靶点及信号通路，预测竹叶椒挥发油多成分、多层次、多途径的抗炎、镇痛潜在作用机制，为竹叶椒药用价值的深入研究与临床合理使用提供科学依据。1 材料 1.1 药材 竹叶椒购自四川省洪雅县，经西南民族大学药学院顾健教授鉴定为芸香科花椒属植物竹叶椒Z. armatum DC.的果实。1.2 试剂 无水硫酸钠（批号20200612）购自天津福晨化学试剂有限公司。1.3 仪器 QP2010 Ultra GC-MS仪（日本Shimadzu公司）；DZTW型电子调温电热套（浙江力凡仪器科技有限公司）；JA2003电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。2 方法 2.1 竹叶椒挥发油的GC-MS分析 2.1.1 竹叶椒挥发油的制备 采用水蒸气蒸馏法提取竹叶椒挥发油，无水硫酸钠脱水，精密吸取1 mL，经0.22 μm滤膜滤过，得到供GC-MS分析的挥发油样品。 2.1.2 气相色谱条件 DB-130毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流比为150∶1；压力为48 kPa；柱箱温度为50 ℃；进样温度为300 ℃；吹扫体积流量为3.0mL/min；色谱柱初始温度为50 ℃，min升温至300 ℃，保持20 min；进样量为2 μL；载气为氦气。 2.1.3 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；离子源温度为230 ℃；接口温度为300 ℃；溶剂延迟时间为2.00min；每0.3秒扫描采集数据，扫描速度为2000，扫描范围为m/z 30～550。 2.2 竹叶椒挥发油成分的潜在作用靶点收集 基于GC-MS获得的竹叶椒挥发油化学成分信息，采用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）进行成分查询及靶点收集。对于TCMSP未收录的其他竹叶椒挥发油成分，借助PubChem数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.）查询成分相应SMILES号，进一步采用Swiss Target Prediction数据库（http://www./）进行靶点预测补充[6]。2.3 “成分-靶点-疾病”网络构建 在OMIM（http:// www.omim.org/）和GisGeNET（http://www.disgenet. org）数据库中，以“炎性反应”“疼痛”为关键词搜索相关靶点，去除重复和假阳性靶点，构建炎性反应、疼痛靶点数据集[7]。分别构建“成分-靶点”和“疾病-靶点”网络模型，运用Cytoscape 3.7.2软件将2个网络合并，去除无关联节点，得到竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的活性成分及主要靶点，借助Uniprot（https://www./）数据库将靶点名称转化为相应基因简称。2.4 靶点的组织分布网络构建 将获得的靶点导入BioGPS（http://biogps. org/#goto＝welcome）数据库，获得靶点与组织的对应关系，并采用Cytoscape 3.7.2软件构建“靶点-组织”网络，以基因表达量为指标筛选前10个靶点主要分布的器官、组织或部位，获得竹叶椒挥发油抗炎、镇痛靶点的组织分布[8]。2.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 将“2.3”项下获得的主要靶点输入STRING在线数据库（https:///），设置“Homo sapiens”，获得PPI关系，结果保存为RTF格式，将节点及结合作用评分数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建与分析，筛选核心靶点[9]。 2.6 基因本体论（gene ontology，GO）功能与京都基因及基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG）通路富集分析 将筛选得到的竹叶椒挥发油抗炎、镇痛靶点导入DAVID数据库（https://david./home.jsp），设置“Homosapiens”，进行GO功能及KEGG通路富集分析[10-11]，采用Graphpad Prism 8软件及在线绘图站Omishare（http://www./tools/index.php/）将结果可视化。2.7 分子对接验证 通过PDB数据库下载前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase2，PTGS2）、毒蕈碱型乙酰胆碱受体亚型3（muscarinic acetylcholine receptorM3，CHRM3）、过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptoralpha，PPARA）和大麻素受体2（cannabinoid receptor 2，CNR2）4个核心靶点蛋白的晶体复合物，借助Discovery Studio软件进行蛋白修饰，去除其配体与非蛋白分子，以pdb格式保存，采用OpenBable GUI软件转为pdbqt格式。借助PubChem在线数据库获取主要活性成分的2D结构，采用Sybyl软件对各成分进行能量优化。利用AutoDock Vina软件进行分子对接，以结合能评价竹叶椒挥发油潜在活性成分与4个靶点蛋白的结合能力[12]。3 结果 3.1 竹叶椒挥发油化学成分的定性表征 采用GC-MS法测定竹叶花椒挥发油中的化学成分，总离子流见图1。通过气相色谱-质谱数据库NIST08.LIB数据匹配，结合文献资料解析，鉴定出竹叶椒挥发油化学成分44个，其中烯烃类成分23个、醇类成分7个、酯类成分2个、苯及其衍生物1个、其他类型及未知成分11个。如表1所示，芳樟醇占比最高，为29.78%；柠檬烯占比为15.35%，β-月桂烯占比为14.42%。
3.2 “成分-靶点-疾病”网络的构建与分析
3.3 靶点与组织分布关联网络的构建与分析
如图3所示，靶点-组织分布网络包含126个节点、782条边，平均度值为9.63，圆形节点代表潜在作用靶点，长方形节点代表相关靶点可能分布的组织或器官，边代表靶点与组织之间的相互作用关系。44个靶点分布于淋巴组织，43个靶点分布于肝脏，41个靶点分布于心肌细胞，37个靶点分布于心脏。此外，CD33、CD34、CD14、CD56等靶点分布于抗原蛋白。因此，竹叶椒挥发油可能通过作用于多种组织或器官的靶点，从而发挥抗炎、镇痛作用，且免疫调控可能是其主要作用机制之一。
3.4 PPI网络的构建与分析
如图4所示，PPI网络共有75个节点、519条边，平均度值为13.8。PCYT1A、SIGMAR1、IGHG1未参与PPI，因此予以剔除。度值≥3的靶点占总靶点的93.33%，度值＞20的靶点主要包含PTGS2、IL6、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、细胞肿瘤抗原p53（cellulartumor antigen p53，TP53）、NOS3、β-淀粉样蛋白前体蛋白（amyloid-βprecursor protein，APP）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、IL1B等。将PPI网络数据导入Cytoscape 3.7.2软件，筛选出大于平均度值的靶点33个见图5，提示这些靶点可能在竹叶椒挥发油抗炎、镇痛中发挥重要作用。
3.5 GO功能分析 借助DAVID数据库对筛选得到的核心靶点进行GO功能分析，即从生物过程、细胞组分和分子功能3个方面进行基因功能注释。共获得130个GO条目（P＜0.01），其中85个涉及生物过程、16个涉及细胞组分、29个涉及分子功能。以基因数进行降序排列，各选取前15个条目，如图6所示，生物过程结果显示，竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的靶点主要与RNA聚合酶II启动子转录的正调控、细胞增殖负调控、信号转导、氧化还原进程、炎性反应等有关；分子功能结果显示，竹叶椒挥发油抗炎、镇痛作用主要与酶结合、锌离子结合、同蛋白结合、受体结合及序列特异性DNA结合等方面相关；细胞组分结果显示，竹叶椒挥发油可能作用于质膜、膜的整体组成、质膜的组成部分、胞外区、细胞外空间等，从而发挥抗炎、镇痛作用。
3.6 KEGG靶点通路富集分析
共筛选得到60条信号通路，选取P值较小的20条信号通路进行可视化，如图7所示，竹叶椒挥发油的抗炎、镇痛机制主要与神经活性配体受体相互作用（neuroactiveligand-receptor interaction）、5-羟色胺能突触（serotonergicsynapse）、胰岛素抵抗（insulinresistance）、花生四烯酸代谢（arachidonicacid metabolism）、钙信号通道（calciumsignaling pathway）、磷酯酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路相关。
3.7 竹叶椒挥发油中主要活性成分与核心靶点的分子对接
为进一步验证竹叶椒挥发油抗炎、镇痛核心靶点与活性成分间的相互作用，筛选“成分-靶点-疾病”网络中12个活性成分（中心度值＞3）及2种临床药物（阿司匹林、塞来昔布）与4个核心靶点（PTGS2、CHRM3、PPARA、CNR2）进行分子对接分析，结果如表2所示，结合能越小，表明配体与蛋白间的亲和力越高，结合能＜−5.0 kJ/moL表明活性成分与靶点具有较强的亲和活性。12个活性成分与4个核心靶点的结合能均＜−6.5 kJ/moL，表明竹叶椒挥发油活性成分与4个核心靶点均有较好的亲和能力，其中ZA43、ZA28与PTGS2、CHRM3、PPARA和CNR2的结合能均＜−10.0 kJ/mol，且结合体构象较稳定，分子对接模式见图8。
4 讨论 竹叶椒又名山花椒、狗椒、野花椒等，始载于《本草图经》，是我国花椒种质资源的特色品种，主要分布于我国西南各省[13]。竹叶椒在四川产量极为丰富，常用于治疗风湿、疼痛及跌打损伤等[14]。为深入挖掘竹叶椒的药用资源价值，本研究基于中药多成分、多靶点的特点，应用生物网络分析结合分子对接预测竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的“成分-靶点”相互作用，进而探索其潜在的作用机制。基于GC-MS的化学物质组研究定性鉴别竹叶椒挥发油中44个化学成分，其中芳樟醇、柠檬烯和β-月桂烯占比较高，占比均＞14%，与已报道的四川产竹叶椒挥发油组分表征结果一致[15]。然而，相关研究表明浙江产竹叶椒中以桉叶油醇和α-松油醇占比较高，分别为37.96%、17.62%；湖北产竹叶椒则以桉叶油醇和萜品烯占比较高，占比分别为36.19%、21.31%[13,16]。由此可见，与浙江和湖北等产地的竹叶椒相比，本研究所采用的四川产竹叶椒在挥发油组分的化学组成和主要成分含量上可能存在较大差别。因此，可进一步基于挥发油特征成分的“质-量”进行不同产地的竹叶椒质量标志物（quality marker，Q-Marker）的筛选，从而为该药材产地的精准溯源和有效鉴别提供科学依据。四川产竹叶椒挥发油中主要成分芳樟醇在醋酸、谷氨酸诱导的多种疼痛动物模型中均表现出显著镇痛作用[17-18]；柠檬烯对溃疡性结肠炎和呼吸系统炎症损伤均具有改善作用[19-20]；月桂烯对热板、福尔马林、坐骨神经压迫刺激诱导的小鼠疼痛均有明显抑制作用[21-22]；芝麻素可显著抑制LPS诱导的小鼠足巨噬细胞中一氧化氮（nitric oxide，NO）、TNF-α、IL-6、前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）的表达和释放[23]，提示竹叶椒挥发油可能通过多种成分协同发挥抗炎、镇痛作用。为进一步探讨竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的作用机制，本研究构建“成分-靶点-疾病”网络筛选其可能的作用靶点蛋白群，并对相关靶点进行组织分布、PPI、GO功能富集及KEGG通路富集分析。组织分布结果显示，竹叶椒挥发油所对应的78个靶点主要富集于淋巴组织、肝脏、心肌细胞和心脏，为其针对特定组织或器官的抗炎、镇痛作用提供了一定依据。富集结果显示，竹叶椒挥发油抗炎、镇痛相关的通路主要涉及神经活性配体受体相互作用、5-羟色胺能突触、花生四烯酸代谢及PI3K/Akt信号通路等，并涉及RNA聚合酶II启动子转录的正调控、酶结合、质膜等多种生物学过程。综合“成分-靶点-疾病”网络与PPI分析结果，筛选得到PTGS2（对应21个成分）、CHRM3（对应9个成分）、PPARA（对应6个成分）和CNR2为竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的潜在核心靶点。PTGS2是一种PTGS的诱导型同工酶（COX-2），COX-2是抑制前列腺素介导的炎性反应和疼痛的经典药物靶点。CHRM3为毒蕈碱型乙酰胆碱受体，在胰腺炎、胆管炎、呼吸道炎性反应等疾病发生中具有重要作用[24-26]。通过M3-乙酰胆碱受体（acetylcholinereceptor，AChR）/蛋白激酶C（proteinkinase C，PKC）/核因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）途径介导的CHRM3受体的激活可能会促进IL-8表达，调节CHRM3表达可以作为一种潜在治疗炎性疾病的方法[27]。PPARA主要参与脂肪酸及其衍生物的氧化代谢，PPARA激动剂能够有效抑制多种炎性反应[28-30]。在LPS刺激的人单核细胞中，PPARA的激活能够通过调节活化因子蛋白-1（activatorprotein-1，AP1）和NF-κB信号通路，从而抑制基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）、组织因子（tissue factor，TF）等多种促炎分子的产生；小鼠巨噬细胞中PPARA缺乏后，其抗炎作用减弱，提示PPARA参与炎性反应的调控[31]。CNR2作为一种G蛋白偶联受体，为内源性大麻素系统的重要组成部分，与疼痛感知、炎性反应密切相关[32]。CNR2激动剂可改善结肠炎、动脉粥样硬化、多发性硬化及缺血再灌注损伤中的炎性反应，并能够有效减轻癌症诱发的骨疼痛[33-34]。分子对接结果显示，竹叶椒挥发油中主要活性成分与4个核心靶点均具有较好的亲和力，验证了采用网络分析所筛选的PTGS2、CHRM3、PPARA和CNR2 4个核心靶点的可靠性。(−)-β-花柏烯、胆甾烯基豆蔻酸酯、芝麻素及β-榄香烯等微量成分与4个核心靶点的亲和能力较强，结合能均＜−8.0 kJ/moL；芝麻素与4个核心靶点的亲和力均优于阳性药物阿司匹林和塞来昔布，表明竹叶椒挥发油中除含量较高的芳樟醇等成分以外，多种微量成分仍可能通过多靶点协同发挥抗炎、镇痛作用。因此，可进一步结合亲和超滤及配体垂钓等实验技术验证以上活性成分与靶点的亲和作用及相关生物学活性。综上所述，本研究基于GC-MS技术定性表征竹叶椒挥发油的化学成分，并结合网络药理学与分子对接筛选并验证其主要活性成分的作用靶点，初步探讨了竹叶椒挥发油抗炎、镇痛的潜在作用机制，为进一步阐明竹叶椒的抗炎、镇痛机制提供了一定的研究方向和数据支持。 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略） 来 源：龚普阳，潘烨华，郭瑜婕，哈立洋，李晓朋，顾 健．基于气相色谱-质谱联用结合网络药理学探究竹叶椒挥发油抗炎镇痛的作用机制 [J]. 中草药, 2021, 52(11): 3296-3305 .
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